ClearLLab 10C - Versione italiana

COMBINAZIONI DI ANTICORPI CE PER L’ANALISI DI LEUCEMIE/LINFOMI* PANNELLI C LEAR LL AB 10C

CASEBOOK

Ogni evento è importante * Solo linfoma non Hodgkin

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Beckman Coulter - Pannelli ClearLLab 10C - C33351 AB

SOMMARIO

INTRODUZIONE....................................................................3 CONTESTO.............................................................................3 RACCOMANDAZIONI CONDIVISE PER L’IMMUNOFENOTIPIZZAZIONE........................................4 USO PREVISTO DEI PANNELLI CLEARLLAB 10C.........4 PANNELLI CLEARLLAB 10C..............................................4 KIT DI COMPENSAZIONE CLEARLLAB..........................5 SCELTA E INTERPRETAZIONE DEL CASO.....................5 DOCUMENTI CORRELATI...................................................6 BIBLIOGRAFIA......................................................................6 CASI.........................................................................................7 NESSUNA ANOMALIA IMMUNOFENOTIPICA...............7 SANGUE INTERO PERIFERICO......................................7 Caso 1: Sangue intero normale.................................7 MIDOLLO OSSEO............................................................. 32 Caso 2: Midollo osseo normale.............................. 32 LINFONODI.........................................................................56 Caso 3: Linfonodo normale.....................................56 PROCESSO NEOPLASTICO DELLE CELLULE B......... 80 LEUCEMIA LINFOBLASTICA B/ LEUCEMIA LINFOBLASTICA.......................................80 Caso 4: Leucemia linfoblastica acuta B/ Linfoma linfoblastico................................................. 80 LEUCEMIA LINFOBLASTICA B/ LEUCEMIA LINFOBLASTICA..................................... 105 Caso 5: Leucemia linfoblastica acuta B/ Linfoma linfoblastico................................................ 105 LEUCEMIA LINFOCITICA CRONICA/ PICCOLO LINFOMA LINFOCITICO.......................... 130 Caso 6: Leucemia linfocitica cronica/ Piccolo linfoma linfocitico...................................... 130 LEUCEMIA LINFOCITICA CRONICA/ PICCOLO LINFOMA LINFOCITICO.......................... 154 Caso 7: Leucemia linfocitica cronica/ Piccolo linfoma linfocitico...................................... 154 LINFOMA MANTELLARE.............................................178 Caso 8: Linfoma mantellare....................................178 MIELOMA DELLE CELLULE DEL PLASMA.......... 202 Caso 9: Mieloma delle cellule del plasma...... 202 LINFOMA FOLLICOLARE............................................226 Caso 10: Linfoma follicolare.................................. 226

LINFOMA DELLE CELLULE B DEL CENTRO GERMINATIVO................................................................ 250 Caso 11: Linfoma delle cellule B del centro germinativo..................................................................250 LINFOMA A CELLULE B MATURE...........................274 Caso 12: Linfoma a cellule B mature.................274 LINFOMA A CELLULE B MATURE.......................... 298 Caso 13: Linfoma a cellule B mature................ 298 PROCESSO NEOPLASTICO DELLE CELLULE T....... 322 LEUCEMIA LINFOBLASTICA T/ LEUCEMIA LINFOBLASTICA.....................................322 Caso 14: Leucemia linfoblastica a T/ Linfoma linfoblastico a cellule T..........................322 LEUCEMIA LINFOBLASTICA T/LEUCEMIA LINFOBLASTICA............................................................ 346 Caso 15: Leucemia linfoblastica a T/ Linfoma linfoblastico a cellule T.........................346 LINFOMA GRANULARE A GRANDI CELLULE T................................................ 370 Caso 16: Malattia linfoproliferativa a cellule T...................................................................... 370 LINFOMA GRANULARE A GRANDI CELLULE T................................................ 394 Caso 17: Malattia linfoproliferativa a cellule T......................................................................394 PROCESSO NEOPLASTICO DI ORIGINE MIELOIDE....................................................418 LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA................................... 418 Caso 18: Leucemia mieloide acuta..................... 418 LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA.................................. 442 Caso 19: Leucemia monocitica acuta..............442 LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA.................................. 466 Caso 20: Leucemia mieloide acuta-NOS.......466 LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA..................................490 Caso 21: Leucemia promielocitica acuta........490 LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA................................... 514 Caso 22: Leucemia monocitica acuta.............. 514 SINDROME MIELODISPLASTICA.............................538 Caso 23: Sindrome mielodisplastica................ 538 SINDROME MIELODISPLASTICA............................ 562 Caso 24: Sindrome mielodisplastica................ 562

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INTRODUZIONE Questo casebook è stato progettato per assistere nell’analisi dei dati di immunofenotipizzazione citometrica a flusso generati utilizzando il reagente a marchio CE-IVD per pannelli ClearLLab 10C di Beckman Coulter per l’analisi di leucemie e linfomi sui citometri a flusso Navios e Navios EX di Beckman Coulter. Sono inclusi casi di esempio con risultati caratteristici tipici di diverse neoplasie linfoidi e mieloidi, così come i casi di pazienti con risultati clinici e/o di laboratorio che suggeriscono un processo neoplastico sottostante, ma in cui non viene identificata alcuna anomalia immunofenotipica. I tipi di campione includono sangue intero periferico, midollo osseo e linfonodi. Ogni caso include un riquadro riassuntivo della situazione clinica che descrive i dati anagrafici e l’anamnesi clinica del paziente, i file dati di Listmode specifici del caso relativi alla rianalisi da parte dell’utente di questo casebook, i protocolli di analisi specifici per ClearLLab 10C da utilizzare con i dati di Listmode e un referto che mostra l’analisi con i protocolli forniti. Ogni referto include note di analisi che mettono in evidenza i risultati immunofenotipici e i potenziali rischi. NOTA: Gli esempi del casebook sono forniti solo a scopo illustrativo: in esso non sono rappresentate tutte le categorie di neoplasie ematolifoidi e non vengono descritte o dimostrate tutte le possibili varianti immunofenotipiche. CONTESTO L’immunofenotipizzazione citometrica a flusso valuta la presenza e l’assenza di antigeni specifici per ogni singola cellula presente nel campione. Se considerati nell’insieme, questi risultati generano un profilo immunofenotipico per ogni cellula coerente con una popolazione attesa (ossia normale) o incoerente con una popolazione attesa (ossia aberrante) in quel tipo di campione. La valutazione dei campioni da pazienti con presunti tumori maligni ematolinfoidi prevede diversi passaggi 1 :

• Valutazione di tutte le popolazioni cellulari nel campione.

• Classificazione di ogni popolazione cellulare come “normale” o “aberrante”.

• Caratterizzazione dettagliata della popolazione aberrante in base alla presenza o all’assenza degli antigeni nonché all’aumento o alla riduzione dell’intensità di colorazione mediante anticorpi marcati con fluorocromo. • Interpretazione dell’immunofenotipo aberrante, con l’integrazione delle informazioni aggiuntive eventualmente disponibili quali anamnesi clinica, istologia, citologia, immunoistochimica e studi sulla genotipizzazione come ibridazione in sito, cariotipizzazione e diagnostica molecolare.

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RACCOMANDAZIONI CONDIVISE PER L’IMMUNOFENOTIPIZZAZIONE Negli ultimi vent’anni sono emerse raccomandazioni condivise per l’immunofenotipizzazione citometrica a flusso di campioni da pazienti con tumori maligni ematolinfoidi noti o presunti e sono state inoltre pubblicati varie linee guida nella letteratura scientifica. L’immunofenotipizzazione citometrica a flusso è inclusa dal 2008 nella classificazione dell’OMS dei Tumori del sistema ematopoietico e del tessuto linfoide 2 . Le indicazioni mediche e la validazione delle analisi di citometria a flusso, comprensiva dei dettagli pre-analitici, analitici e post-analitici dei test, sono affrontate nelle raccomandazioni della Bethesda International Consensus Conference del 2006 3,4,5 e nelle linee guida pratiche di ICSH/ICCS per le analisi a fluorescenza sulle cellule 6,7,8 . USO PREVISTO DEI PANNELLI ClearLLab 10C I pannelli ClearLLab 10C servono per uso diagnostico in vitro per l’identificazione qualitativa delle popolazioni cellulari tramite immunofenotipizzazione multiparametro sui citometri a flusso Navios e Navios EX. Questi reagenti vengono utilizzati come aiuto nella diagnosi differenziale dei pazienti ematologicamente anomali che sono affetti, o si sospetta siano affetti, dalle seguenti neoplasie ematopoietiche: leucemia cronica, leucemia acuta, linfoma non di Hodgkin, mieloma, sindrome mielodisplastica (MDS) e/o neoplasmi mieloproliferativi (MPN). I reagenti possono essere utilizzati con sangue intero periferico (raccolto in K 2 EDTA, ACD o eparina), midollo osseo (raccolto in K 2 EDTA, ACD o eparina) e campioni di linfonodi. L’interpretazione dei risultati deve essere confermata da un patologo o da un professionista equivalente insieme ad altri reperti clinici e di laboratorio.

Questi reagenti forniscono risultati qualitativi multiparametro per gli antigeni di superficie elencati di seguito:

Pannelli ClearLLab 10C

Laser blu

Laser rosso

Laser viola

Codice articolo Provetta

APC- A750 PB KRO

FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC- A700

B96805 Provetta per cellule B

Kappa Lambda CD10 CD5 CD200 CD34 CD38 CD20 CD19 CD45

B96806 Provetta per cellule T

CD4

CD2 CD56 CD5 CD34 CD7

CD8

CD3 CD45

TCR γδ

B96807 Provetta per cellule M1

CD16

CD7

CD10 CD13 CD64 CD34 CD14 HLA-DR CD11b CD45

B96808 Provetta per cellule M2

CD15

CD123 CD117 CD13 CD33 CD34 CD38 HLA-DR CD19 CD45

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KIT DI COMPENSAZIONE ClearLLab

Laser blu

Laser rosso

Laser viola

Codice articolo

APC- A750 PB KRO

FITC

PE

ECD PC5.5

PC7

APC APC- A700

B74074

CD4

CD4

CD3

CD4

CD4

CD4

CD4

CD4

CD4

CD8

Il reagente sopra indicato è fornito in un formato standardizzato per l’uso con i reagenti nella preparazione dei campioni e nella configurazione del citometro, insieme al software per l’acquisizione dei dati e l’analisi. I pannelli ClearLLab 10C rispettano le raccomandazioni di standardizzazione descritte dalle linee guida di Bethesda 2 . Informazioni aggiuntive sui pannelli ClearLLab 10C sono disponibili all’indirizzo beckman.com/ClearLLab . SCELTA E INTERPRETAZIONE DEL CASO

I dati presentati in questo casebook sono stati generati attenendosi alla procedura descritta in ClearLLab 10C Panel Instructions For Use (IFU) (Istruzioni per l’uso del pannello ClearLLab 10C) disponibili all’indirizzo beckman.com .

I casi rappresentativi sono stati scelti tra i dati dei trial clinici e sono stati rivisti, annotati e interpretati da:

Brent Wood, MD, PhD Professore, Medicina di laboratorio e patologia Responsabile della divisione, Ematopatologia Direttore, Laboratorio di ematopatologia e patologia SCCA Direttore medico, Laboratori SCCA Università di Washington, Seattle, WA, USA Xueyan Chen, MD, PhD Professore assistente, Medicina di laboratorio Direttore associato, Laboratorio di ematopatologia Università di Washington, Seattle, WA

Yi Zhou, MD, PhD Professore assistente

Dipartimento di medicina di laboratorio Università di Washington, Seattle, WA

Protocolli di analisi: Scarica il protocollo di analisi ClearLLab 10C. Analisi: Scarica i file di analisi Kaluza C specifici per il caso.

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DOCUMENTI CORRELATI

BIBLIOGRAFIA 1. Flow Cytometric Immunophenotyping for Hematologic Neoplasms. F.E. Craig, K.A. Foon. Blood. 2008; 111; 3941–3967. 2. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe EA, Pileri SA, Stain H, Thiele J, & Vardiman JW (eds) (2008) WHO Classification of Tumors of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. IARC Press: Lyon 3. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Swerdlow SH, et al. Blood. 2016;127:2375–90. 4. The 2016 revision of the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Arber DA, et al. Blood 2016 127:2391–2405. 5. 2006 Bethesda International Consensus recommendations on the immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasia by flow cytometry: optimal reagents and reporting for the flow cytometric diagnosis of hematopoietic neoplasia. Wood BL, Arroz M, Barnett D, DiGiuseppe J, Greig B, Kussick SJ, Oldaker T, Shenkin M, Stone E, Wallace P. Cytometry B Clin Cytom. 2007;72 Suppl 1:S14–22 6. 2006 Bethesda International Consensus recommendations on the flow cytometric immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasia: medical indications. Davis BH, Holden JT, Bene MC, Borowitz MJ, Braylan RC, Cornfield D, Gorczyca W, Lee R, Maiese R, Orfao A, Wells D, Wood BL, Stetler-Stevenson M. Cytometry B Clin Cytom. 2007;72 Suppl 1:S5–13 7. 2006 Bethesda International Consensus Conference on Flow Cytometric Immunophenotyping of Hematolymphoid Neoplasia. Stetler-Stevenson M, Davis B, Wood B, Braylan R. Cytometry B Clin Cytom. 2007;72 Suppl 1:S3 8. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS - part III - analytical issues. Tanqri S, Vall H, Kaplan D, Hoffman B, Purvis N, Porwit A, Hunsberger B, Shankey TV; ICSH/ICCS Working Group. Cytometry B Clin Cytom. 2013 Sep-Oct;84(5):291–308. doi: 10.1002/cyto.b.21106 9. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS - part IV - postanalytic considerations. Barnett D, Louzao R, Gambell P, De J, Oldaker T, Hanson CA; ICSH/ICCS Working Group. Cytometry B Clin Cytom. 2013 Sep-Oct;84(5):309–14. doi: 10.1002/cyto.b.21107 10. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS - part V - assay performance criteria. Wood B, Jevremovic D, Béné MC, Yan M, Jacobs P, Litwin V; ICSH/ICCS Working Group. Cytometry B Clin Cytom. 2013 Sep-Oct;84(5):315–23. doi: 10.1002/cyto.b.2110 • ClearLLab 10C Application System Guide (Guida di sistema per l’applicazione ClearLLab 10C), codice articolo C28517AA • Kaluza C Flow Cytometry Software Instructions For Use (Istruzioni per l’uso del software di citometria a flusso Kaluza C), codice articolo C20155 • Navios Flow Cytometer Instructions For Use (Istruzioni per l’uso del citometro a flusso Navios), codice articolo 774531AG • Navios EX Flow Cytometer Instructions For Use (Istruzioni per l’uso del citometro a flusso Navios EX), codice articolo B77110AC • ClearLLab 10C Panels Instructions For Use (Istruzioni per l’uso dei pannelli ClearLLab 10C), codice articolo C00197 • ClearLLab Compensation Beads Instructions For Use (Istruzioni per l’uso delle sfere ClearLLab Compensation Beads), codice articolo C00201 • ClearLLab Compensation Kit Instructions For Use (Istruzioni per l’uso del kit di compensazione ClearLLab), codice articolo B74074 • ClearLLab Control Cells Instructions For use (Istruzioni per l’uso di ClearLLab Control Cells), codice articolo B99884 • Addendum al download del protocollo di analisi QC di ClearLLab Control Cells, codice articolo C33259AA

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CASI Ai casi è applicato il seguente gating di precedenza dei colori:

Linfociti (gate Ly)/cellule NK: rosso Cellule B CD19+: arancione Cellule T CD3+: celeste

Monociti (gate Mo): verde Granulociti (gate Gr): blu CD45dim: viola

Popolazioni aberranti aggiuntive: verde petrolio Popolazione negativa CD45: grigio

NESSUNA ANOMALIA IMMUNOFENOTIPICA La citometria a flusso è un mezzo per caratterizzare le popolazioni leucocitarie. Questa tecnica può essere d’aiuto nella diagnosi differenziale dei pazienti ematologicamente anomali che sono affetti, o si presume siano affetti, da neoplasie ematopoietiche quali leucemia cronica, leucemia acuta, linfoma non Hodgkin, mieloma, sindrome mielodisplastica (MDS) e/o neoplasie mieloproliferative (MPN). Fondamentale per l’identificazione delle popolazioni aberranti in queste situazioni cliniche è la familiarità con le popolazioni cellulari normali nel sangue intero, nel midollo osseo e nei campioni di tessuto dei linfonodi. Di seguito sono riportati esempi di campioni normali colorati con i pannelli ClearLLab 10C.

SANGUE INTERO PERIFERICO Caso 1: Sangue intero normale

Quadro clinico

Uomo di 65 anni con trombocitopenia. Un campione di sangue intero periferico viene sottoposto a immunofenotipizzazione citometrica a flusso utilizzando i pannelli ClearLLab 10C. Immunofenotipizzazione citometrica a flusso

Provetta per cellule B

Figura 1. Questo diagramma a punti Time vs CD45 è senza gate e mostra tutti gli eventi raccolti in sequenza. Il diagramma serve per valutare le perturbazioni fluidiche durante l’acquisizione del campione. L’acquisizione stabile è rappresentata da un modello uniforme di eventi nel tempo. Gli eventi che si discostano dal modello stabile possono essere esclusi nel gate Time (Tempo).

Figura 2. Questo diagramma a punti FS INT vs FS PEAK mostra gli eventi nel gate Time (Tempo). In questo diagramma sono esclusi i doppioni o gli aggregati cellulari. Gli eventi singolettomostrano una relazione lineare per INT vs PEAK e sono inclusi nel gate Singlets (Singoletti), mentre i doppietti si trovano al di fuori della relazione lineare.

Sommario > Nessuna anomalia immunofenotipica > Caso 1: Sangue intero normale

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Provetta per cellule B

Figura 3. Questo diagramma a punti Side Scattering vs Scatter frontale mostra gli eventi nel gate Singlets (Singoletti). In questo diagramma sono esclusi i frammenti cellulari, che di solito hanno uno scatter frontale ridotto. Le cellule apoptotiche precoci denotano anche un side scattering leggermente aumentato, mentre le cellule apoptotiche in stadio avanzato e necrotiche denotano un side scattering diminuito in modo variabile. Le cellule vitali sono incluse nel gate Cells (Cellule).

Figura 4. Questo diagramma a punti CD45 vs Side Scattering mostra gli eventi nel gate Cells (Cellule). Il diagramma ha lo scopo di evidenziare varie sottopopolazioni di leucociti, che hanno un gate CD45 positivo. La popolazione di CD45 negativi solitamente comprende eritrociti, aggregati piastrinici, residui tissutali o cellule non ematopoietiche.

Figura 6. Questo diagramma a punti CD19 vs Side Scatteringmostra gli eventi nel gate Cells (Cellule). Il gate CD19+ identifica le cellule CD19 positive. Il CD19 è espresso su cellule B mature e immature, così come sulla maggior parte delle cellule del plasma. Queste cellule hanno solitamente un side scattering da basso a moderato.

Figura 5. Questo diagramma a punti CD45 vs Side Scattering mostra gli eventi nel gate CD45+. Il diagramma a punti consente di distinguere diverse popolazioni di globuli bianchi solitamente presenti nei campioni di sangue periferico, midollo osseo e linfonodi, inclusi i linfociti (gate Ly, in rosso/arancione), i monociti (gateMo, in verde) e i granulociti (gateGr, in blu). Il gate CD45dim(viola) copre l’area solitamente occupata dai progenitori precoci, cioè i mieloblasti e le cellule B immature. Anche i basofili, le cellule dendritiche dei plasmacitoidi, le cellule del plasma e le cellule NK possono comparire in quest’area. Applicando colori diversi agli eventi compresi in ciascun gate, è possibile identificare le varie popolazioni durante l’analisi.

Sommario > Nessuna anomalia immunofenotipica > Caso 1: Sangue intero normale

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Provetta per cellule B

Figura 7. Questo diagramma a punti Kappa vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali.Lacatena leggerakappadisuperficieèespressasucelluleBmature(inarancione) e cellule B immature in stadio avanzato. La proporzione di cellule B kappa positive è normalmente maggiore di quella delle cellule B kappa negative (lambda positive). L’evidente positività kappa è visibile sui monociti (in verde) in virtù del legamemediato dal recettore Fc dell’immunoglobulina. Le cellule positive a catena leggera Kappa sono riportate sul lato destro del diagramma.

Figura 8. Questo diagramma a punti Lambda vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. La catena leggera lambda di superficie è espressa su cellule B mature (in arancione) e cellule B immature in stadio avanzato. La proporzione di cellule B lambda positive è normalmente inferiore a quella delle cellule B lambda negative (kappa positive). L’evidente positività lambda è visibile sui monociti (in verde) in virtù del legamemediato dal recettore Fc dell’immunoglobulina. Le cellule positive a catena leggera lambda sono riportate sul lato destro del diagramma.

Figura 9. Questo diagramma a punti CD10 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD10 è espresso su cellule B immature, cellule Bmature del centro germinativo e granulociti maturi (in blu). I granulociti hanno un elevato side scattering, a differenza delle cellule linfoidi che hanno un side scattering basso.

Figura 10. Questo diagramma a punti CD5 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD5 è espresso su cellule T immature e mature (in rosso in basso a destra), nonché debolmente su una sottopopolazione di cellule B mature (in arancione). Queste cellule linfoidi hanno solitamente un side scattering basso.

Sommario > Nessuna anomalia immunofenotipica > Caso 1: Sangue intero normale

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Provetta per cellule B

Figura 11. Questo diagramma a punti CD200 vs Side Scatteringmostra tutte le cellule vitali. Il CD200 è espresso solitamente su cellule B, ma è negativo in alcune cellule B neoplastiche. È particolarmente utile per distinguere il linfoma mantellare (di solito CD200 negativo) dalla leucemia linfocitaria cronica/piccolo linfoma linfocitario (di solito CD200 positivo).

Figura 12. Questo diagramma a punti CD34 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD34 è un marcatore dei progenitori ematopoietici precoci. È espresso sulle cellule staminali ematopoietiche, sui progenitori mieloidi (mieloblasti) precoci e sulle cellule B e T immature (linfoblasti). Granulociti, monociti e linfociti maturi sono negativi per il CD34. I progenitori CD34 positivi rappresentano normalmentemeno dello 0,01% dei globuli bianchi nel sangue periferico.

Figura 14. Questo diagramma a punti CD20 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD20 è espresso su cellule Bmature (in arancione) e a un livello basso inmodo variabile su una sottopopolazione di cellule T mature. È espresso in modo variabile sulle cellule B immature in stadio avanzato. Le cellule CD20 positive si trovano di solito nel gate dei linfociti con basso side scattering.

Figura 13. Questo diagramma a punti CD38 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD38 è un marcatore di attivazione. È espresso al massimo livello sulle cellule del plasma, a un livello moderato sui progenitori mieloidi e linfoidi immaturi, a un livello basso sui monociti (in verde) e a un livello variabile sui linfociti maturi attivati.

Sommario > Nessuna anomalia immunofenotipica > Caso 1: Sangue intero normale

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Provetta per cellule B

Figura15.QuestodiagrammaapuntiLambdavsKappamostratutte lecelluleCD19+.Le celluleB immatureprecoci(inviola)nonesprimonocatene leggeredi immunoglobuline di superficie, cioè negative per la catena leggera kappa o lambda. Le cellule Bmature sono policlonali, che esprimono la catena leggera kappa o lambda. Il normale rapporto kappa-lambda è di 1,4 con un intervallo compreso tra 1 e 2. L’aumento del rumore di fondo dovuto all’aderenza dell’immunoglobulina plasmatica è comune.

Figura 16. Questo diagramma a punti CD19 vs CD20mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). Le cellule Bmature sono espresse sia sul CD19 sia sul CD20 (in arancione). Alcune celluleBneoplastiche possonomostrare un’espressione ridotta di CD19oCD20.

Figura 18. Questo diagramma a punti CD38 vs CD10 mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). Il CD38 è espresso al massimo livello sulle cellule del plasma, a livello moderato su cellule B immature e a basso livello su cellule B del centro germinativo. Lamaggior parte delle cellule Bmature (in arancione) mostra un’espressione da bassa ad assente di CD38. Le cellule T (in rosso) mostrano un’espressione di CD38 variabile a seconda dello stato di attivazione.

Figura 17. Questo diagramma a punti CD19 vs CD10 mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). Le cellule B sono CD19 positivo (in arancione). Le cellule B mature CD10 positive sono distribuite nei centri germinativi nei linfonodi e una piccola sottopopolazione di cellule B immature in stadio avanzato è presente nel sangue periferico e negli aspirati di midollo osseo.

Sommario > Nessuna anomalia immunofenotipica > Caso 1: Sangue intero normale

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Provetta per cellule B

Figura 19. Questo diagramma a punti CD20 vs CD10 mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). La maggior parte delle cellule B mature esprime uniformemente il CD20 di alto livello senza il CD10.

Figura 20. Questo diagramma a punti CD19 vs CD5mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). Il CD5 è espresso su cellule T (in rosso, in alto a sinistra), inmodo variabile a basso livello su una sottopopolazione di cellule B normali mature (in arancione) e su alcuni sottotipi di cellule B neoplastiche.

Figura 22. Questo diagramma a punti CD5 vs CD200 mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). La maggior parte delle cellule B mature normalmente esprimono il CD200 con una sottopopolazione che esprime in modo variabile CD5. Le cellule B neoplastiche nella leucemia linfocitaria cronica o in un piccolo linfoma linfocitario esprimono solitamente il CD5 e il CD200, mentre il linfoma mantellare esprime solitamente il CD5 ma non il CD200.

Figura 21. Questo diagramma a punti CD20 vs CD200mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). La maggior parte delle cellule B mature (in arancione) esprimono CD200 a un livello da basso a moderato.

Sommario > Nessuna anomalia immunofenotipica > Caso 1: Sangue intero normale

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Provetta per cellule T

Figura 1. Questo diagramma a punti Time vs CD45 è senza gate e mostra tutti gli eventi raccolti in sequenza. Il diagramma serve per valutare le perturbazioni fluidiche durante l’acquisizione del campione. L’acquisizione stabile è rappresentata da un modello uniforme di eventi nel tempo. Gli eventi che si discostano dal modello stabile possono essere esclusi nel gate Time (Tempo).

Figura 2. Questo diagramma a punti FS INT vs FS PEAK mostra gli eventi nel gate Time (Tempo). In questo diagramma sono esclusi i doppioni o gli aggregati cellulari. Gli eventi singolettomostrano una relazione lineare per INT vs PEAK e sono inclusi nel gate Singlets (Singoletti), mentre i doppietti si trovano al di fuori della relazione lineare.

Figura 3. Questo diagramma a punti Side Scattering vs Scatter frontale mostra gli eventi nel gate Singlets (Singoletti). In questo diagramma sono esclusi i frammenti cellulari, che di solito hanno uno scatter frontale ridotto con side scattering aumentato. Le cellule apoptotiche precoci denotano anche un side scattering leggermente aumentato, mentre le cellule apoptotiche in stadio avanzato e necrotiche denotano un side scattering diminuito in modo variabile. Le cellule vitali sono incluse nel gate Cells (Cellule).

Figura 4. Questo diagramma a punti CD45 vs Side Scattering mostra gli eventi nel gate Cells (Cellule). Il diagramma ha lo scopo di evidenziare vari tipi di leucociti, che sonoCD45 positivi. La popolazione di CD45 negativi solitamente comprende eritrociti, aggregati piastrinici o cellule non ematopoietiche.

Sommario > Nessuna anomalia immunofenotipica > Caso 1: Sangue intero normale

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Provetta per cellule T

Figura 5. Questo diagramma a punti CD45 vs Side Scattering mostra gli eventi nel gate CD45+. Il diagramma a punti consente di distinguere diverse popolazioni di linfociti solitamente presenti nei campioni di sangue periferico, midollo osseo e linfonodi, inclusi i linfociti (gate Ly, in rosso/celeste), i monociti (gate Mo, in verde) e i granulociti (gate Gr, in blu). Il gate CD45dim (viola) copre l’area solitamente occupata dai mieloblasti e dalle cellule B immature. Anche i basofili, le cellule dendritiche plasmacitoidi, le cellule del plasma e le cellule NK possono rientrare in quest’area. Applicando colori diversi agli eventi compresi in ciascun gate, è possibile seguire le varie popolazioni durante l’analisi.

Figura 6. Questo diagramma a punti CD3 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il gate CD3+ identifica le cellule con espressione di CD3 di superficie (in celeste). Il CD3 è altamente specifico per le cellule T, essendo espresso solo sulla superficie delle cellule Tmature e delle cellule T immature in stadio più avanzato. Queste cellule hanno solitamente un side scattering da basso a moderato.

Figura 8. Questo diagramma a punti CD4 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD4 è espresso su una sottopopolazione di cellule T immature e mature a livello elevato (in celeste). Il CD4 è espresso anche su cellule monocitiche (in verde) a un livello inferiore a quello delle cellule T CD4 positive.

Figura 7. Questo diagramma a punti TCR γδ vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. TCR γδ è una sottounità del recettore delle cellule T ed è espressa su una piccola sottopopolazione di cellule T citotossiche. Queste cellule hanno solitamente un side scattering basso (in celeste).

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Provetta per cellule T

Figura 9. Questo diagramma a punti CD2 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD2 è un antigene espresso da quasi tutte le cellule T immature e mature (in celeste). Il CD2 è espresso anche su cellule NK (in rosso, in basso a destra) e a basso livello su monociti (in verde).

Figura 10. Questo diagramma a punti CD56 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD56 viene normalmente espresso su una sottopopolazione principale di cellule NK (in rosso), cellule T con attività di natural killer (cellule NK/T) e molte cellule T gamma/delta (in celeste). Il CD56 è anche parzialmente espresso su cellule monocitiche (in verde) in condizioni sia reattive sia neoplastiche.

Figura 11. Questo diagramma a punti CD5 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD5 è espresso sulla maggior parte delle cellule T mature (in celeste) e a un livello basso su una sottopopolazione di cellule Bmature. Le cellule T immaturemolto precoci e le cellule T gamma/delta solitamente hanno poca o nessuna espressione CD5. Una piccola sottopopolazione di cellule NK esprime CD5.

Figura 12. Questo diagramma a punti CD34 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD34 è un marcatore dei progenitori ematopoietici precoci. È espresso sulle cellule staminali ematopoietiche, sui progenitori mieloidi (mieloblasti) precoci e sulle cellule B e T immature (linfoblasti). Granulociti, monociti e linfociti maturi sono negativi per il CD34. I progenitori CD34 positivi rappresentano normalmentemeno dello 0,01% dei globuli bianchi nel sangue periferico.

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Provetta per cellule T

Figura 13. Questo diagramma a punti CD7 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD7 è espresso su cellule T immature nelle fasi precoci dello sviluppo delle cellule T e persiste durante tutta la maturazione delle cellule T per essere espresso in modo variabile su cellule Tmature (in celeste). Èanche espresso inmodouniforme sulle celluleNK (in rosso, in basso a destra) e debolmente espresso su una sottopopolazione di cellule dendritiche plasmacitoidi e su una sottopopolazione di progenitori CD34 positivi lineage-committed.

Figura 14. Questo diagramma a punti CD8 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD8 viene espresso su una sottopopolazione di cellule T immature e mature (in celeste) e definisce la popolazione di cellule Tmature citotossiche. Viene espresso in modo variabile a basso livello sulle cellule NK e sulle cellule T gamma-delta.

Figura 15. Questo diagramma a punti CD3 vs CD56 mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). Le cellule T sono definite dall’espressione del CD3, poiché è presente su tutte le cellule T mature e non espresso da cellule di altre linee. Per definizione, le cellule NK non esprimono il CD3 di superficie, ma esprimono il CD56 su una sottopopolazione principale (in rosso, in alto a sinistra). Anche piccole sottopopolazioni di cellule T mature esprimono CD56, in particolare le cellule T con attività di natural killer (cellule NK/T) e cellule T gamma-delta.

Figura 16. Questo diagramma a punti CD5 vs CD3 mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). Il CD3 e il CD5 sono entrambi espressi sulla maggior parte delle cellule T mature (in celeste), anche se una piccola sottopopolazione di cellule T citotossiche con una grande morfologia dei linfociti granulari spesso mostra un’espressione ridotta o addirittura assente di CD5. Sullamaggior parte delle cellule NK, il CD5 non è espresso.

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Provetta per cellule T

Figura 18. Questo diagramma a punti CD8 vs CD4 mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). Le cellule T CD3 positive (in celeste) contengono sottopopolazioni di CD4 positivi (helper) e di CD8 positivi (citotossici). Le cellule T CD4 positive sono di solito più numerose delle cellule T CD8 positive, con un rapporto CD4:CD8 compreso tra 1:1 e 4:1 nel sangue periferico. Sono presenti anche cellule T CD4 e CD8 doppie negative o doppie positive sporadiche. Le cellule T doppie negative sono in genere costituite per lo più da cellule T gamma/delta. Notare che le cellule positive al CD4 ma negative al CD3 (in rosso, in mezzo a sinistra) sono monociti inclusi nel gate dei linfociti. Dimostra che il gate CD45 vs Side Scattering da solo non consente l’identificazione dei linfociti puri.

Figura 17. Questo diagramma a punti CD7 vs CD2 mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). Il CD2 e il CD7 sono entrambi espressi sulla gran parte delle cellule T mature (in celeste) e delle cellule NK (in rosso, in alto a destra).

Figura 19. Questo diagramma a punti CD3 vs CD4 mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). Tutte le cellule T CD4 positive esprimono il CD3. I monociti e le cellule dendritiche plasmacitoidi esprimono il CD4 a un livello inferiore rispetto alle cellule T CD4 positive e non esprimono il CD3. Le cellule NK mancano di espressione sia di CD3 che di CD4.

Figura 20. Questo diagramma a punti CD3 vs CD8 mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). Tutte le cellule T CD8 positive esprimono il CD3 (in celeste). Una piccola sottopopolazione di cellule NK esprime anche il CD8 (in rosso, in alto a sinistra) senza il CD3.

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Provetta per cellule T

Figura 21. Questo diagramma a punti CD3 vs TCR γδ mostra tutte le cellule nel gate dei linfociti (Ly). Una piccola sottopopolazione di cellule T esprime il gamma/delta del TCR, che è co-espresso con il CD3. La relazione altamente lineare tra il CD3 e il TCR è dovuta alla loro presenza come complesso eterodimerico con un rapporto fisso 1:1, per cui unamaggiore espressione dell’unomostra unamaggiore espressione dell’altro.

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Provetta per cellule M1

Figura 1. Questo diagramma a punti Time vs CD45 è senza gate e mostra tutti gli eventi raccolti in sequenza. Il diagramma serve per valutare le perturbazioni fluidiche durante l’acquisizione del campione. L’acquisizione stabile è rappresentata da un modello uniforme di eventi nel tempo. Gli eventi che si discostano dal modello stabile possono essere esclusi nel gate Time (Tempo).

Figura 2. Questo diagramma a punti FS INT vs FS PEAK mostra gli eventi nel gate Time (Tempo). In questo diagramma sono esclusi i doppioni o gli aggregati cellulari. Gli eventi singolettomostrano una relazione lineare per INT vs PEAK e sono inclusi nel gate Singlets (Singoletti), mentre i doppietti si trovano al di fuori della relazione lineare.

Figura 4. Questo diagramma a punti CD45 vs Side Scattering mostra gli eventi nel gate Cells (Cellule). Il diagramma ha lo scopo di evidenziare varie sottopopolazioni di leucociti, che hanno un gate CD45 positivo. La popolazione di CD45 negativi solitamente comprende eritrociti, aggregati piastrinici, residui tissutali o cellule non ematopoietiche.

Figura 3. Questo diagramma a punti Side Scattering vs Scatter frontale mostra gli eventi nel gate Singlets (Singoletti). In questo diagramma sono esclusi i frammenti cellulari, che di solito hanno uno scatter frontale ridotto con side scattering aumentato. Le cellule apoptotiche precoci denotano anche un side scattering leggermente aumentato, mentre le cellule apoptotiche in stadio avanzato e necrotiche denotano un side scattering diminuito in modo variabile. Le cellule vitali sono incluse nel gate Cells (Cellule).

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Provetta per cellule M1

Figura 5. Questo diagramma a punti CD45 vs Side Scattering mostra gli eventi nel gate CD45+. Questo diagramma a punti consente di distinguere diverse popolazioni di globuli bianchi solitamente presenti nei campioni di sangue periferico, midollo osseo e linfonodi, inclusi i linfociti (gate Ly, in rosso), i monociti (gate Mo, in verde) e i granulociti (gate Gr, in blu). Il gate CD45dim (viola) copre l’area solitamente occupata dai mieloblasti e dalle cellule B immature. Anche i basofili, le cellule dendritiche plasmacitoidi, le cellule del plasma e le cellule NK possono rientrare in quest’area. Applicando colori diversi agli eventi compresi in ciascun gate, è possibile seguire le varie popolazioni durante l’analisi.

Figura 6. Questo diagramma a punti CD16 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD16 è espresso al suomassimo livello sui granulociti maturi (in blu). Lamaggior parte delle cellule NK esprime il CD16 (in rosso, in basso a destra), così come una sottopopolazione di monociti attivati (in verde).

Figura 8. Questo diagramma a punti CD10 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD10 è espresso su cellule B immature, cellule Bmature del centro germinativo e granulociti maturi (in blu). I granulociti hanno un elevato side scattering, a differenza delle cellule linfoidi che hanno un side scattering basso.

Figura 7. Questo diagramma a punti CD7 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD7 è espresso su cellule T immature nelle fasi precoci dello sviluppo delle cellule T e persiste durante tutta la maturazione delle cellule T per essere espresso in modo variabile su cellule T mature (in rosso, in basso a destra). È espresso anche sulle cellule NK e debolmente espresso su una sottopopolazione di cellule dendritiche plasmacitoidi e su una sottopopolazione di progenitori lineage-committed.

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Provetta per cellule M1

Figura 9. Questo diagramma a punti CD13 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD13 è espresso sui granulociti in via di maturazione (in blu), sui monociti maturi (in verde) e sui progenitori mieloidi (in viola).

Figura 10. Questo diagramma a punti CD64 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD64 è espresso al suo livello più alto sui monociti maturi (in verde). Il CD64 non è ben espresso sui granulociti maturi a riposo (in blu), ma aumenta in espressione all’attivazione dei granulociti. Il CD64 non è espresso sui linfociti (in rosso) o sulla maggior parte dei progenitori CD34 positivi. I monociti maturi attivati esprimono il CD64 a un livello più basso e presentano uno side scattering inferiore.

Figura 12. Questo diagramma a punti CD14 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD14 è espresso a livello elevato sui monociti maturi (in verde) e a livello basso sui granulociti maturi (in blu). I monociti maturi attivati esprimono il CD14 a un livello più basso e presentano un side scattering inferiore.

Figura 11. Questo diagramma a punti CD34 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD34 è un marcatore dei progenitori ematopoietici precoci. È espresso sulle cellule staminali ematopoietiche, sui progenitori mieloidi (mieloblasti) precoci e sulle cellule B e T immature (linfoblasti). Granulociti, monociti e linfociti maturi sono negativi per il CD34. I progenitori CD34 positivi rappresentano normalmente meno dello 0,01% dei globuli bianchi nel sangue periferico.

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Provetta per cellule M1

Figura 13. Questo diagramma a punti HLA-DR vs Side Scatteringmostra tutte le cellule vitali. L’HLA-DR è espresso su cellule che presentano l’antigene, compresi i monociti (in verde) e le cellule dendritiche plasmacitoidi. È espresso anche su progenitori CD34 positivi, cellule B immature e mature e cellule T attivate.

Figura 14. Questo diagramma a punti CD11b vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD11b è espresso su granulociti (in blu) e su monociti (in verde). Il CD11b è espresso anche su cellule NK e basofili.

Figura 16. Questo diagramma a punti CD16 vs CD13 mostra tutte le cellule vitali. Il CD13 è espresso su granulociti (in blu), monociti (in verde), basofili e progenitori CD34 positivi. Il CD16 è espresso su granulociti inmaturazione (in blu) e una sottopopolazione di cellule NK (in rosso, in basso a destra).

Figura 15. Questo diagramma a punti CD11b vs CD16 mostra tutte le cellule vitali. Il CD11b è espresso sumonociti (in verde), granulociti immaturi ematuri (in blu) e cellule NK (in rosso). Il CD16 è espresso su granulociti immaturi e maturi (in blu) e su una sottopopolazione di cellule NK (in rosso, in alto a destra). I monociti maturi attivati esprimono il CD16 a un livello variabile e sono CD11b positivi.

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Provetta per cellule M1

Figura 17. Questo diagramma a punti CD13 vs CD34 mostra tutte le cellule vitali. Il CD13 è espresso su granulociti (in blu), monociti (in verde), basofili e progenitori CD34 positivi. Il CD34 è espresso su progenitori ematopoietici precoci. Granulociti, monociti e linfociti maturi sono negativi per il CD34.

Figura 18. Questo diagramma a punti CD14 vs CD64 mostra tutte le cellule vitali. Il CD64 è espresso a livello elevato sui monociti (in verde) e a un livello inferiore sui granulociti (in blu). Il CD14 è espresso a livello elevato sui monociti e a un livello inferiore sui granulociti (in blu). I monociti maturi attivati esprimono il CD14 e il CD64 a un livello inferiore variabile.

Figura 20. Questo diagramma a punti HLA-DR vs CD10 mostra tutte le cellule vitali. L’HLA-DR è espresso sui monociti (in verde), sulle cellule B, sulle cellule dendritiche plasmacitoidi e sui progenitori CD34 positivi. Il CD10 è espresso dai granulociti maturi (in blu).

Figura 19. Questo diagramma a punti CD14 vs CD16mostra tutte le cellule vitali. Il CD14 è espresso a livello elevato sui monociti (in verde) e a un livello inferiore sui granulociti (in blu, in alto a sinistra). Il CD16 è espresso sui granulociti e su una sottopopolazione di cellule NK (in rosso, al centro a sinistra). I monociti maturi attivati esprimono il CD14 e il CD16 a un livello inferiore variabile.

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Provetta per cellule M1

Figura 21. Questo diagramma a punti CD7 vs CD13 mostra tutte le cellule vitali. Il CD7 è espresso su cellule T e cellule NK (in rosso, in basso a destra). Il CD13 è espresso su granulociti (in blu), monociti (in verde), basofili e progenitori CD34 positivi. In genere, la co-espressione di CD13 e CD7 non è visibile.

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Provetta per cellule M2

Figura 1. Questo diagramma a punti Time vs CD45 è senza gate e mostra tutti gli eventi raccolti in sequenza. Il diagramma serve per valutare le perturbazioni fluidiche durante l’acquisizione del campione. L’acquisizione stabile è rappresentata da un modello uniforme di eventi nel tempo. Gli eventi che si discostano dal modello stabile possono essere esclusi nel gate Time (Tempo).

Figura 2. Questo diagramma a punti FS INT vs FS PEAK mostra gli eventi nel gate Time (Tempo). In questo diagramma sono esclusi i doppioni o gli aggregati cellulari. Gli eventi singolettomostrano una relazione lineare per INT vs PEAK e sono inclusi nel gate Singlets (Singoletti), mentre i doppietti si trovano al di fuori della relazione lineare.

Figura 4. Questo diagramma a punti CD45 vs Side Scattering mostra gli eventi nel gate Cells (Cellule). Il diagramma ha lo scopo di evidenziare varie sottopopolazioni di leucociti, che hanno un gate CD45 positivo. La popolazione di CD45 negativi solitamente comprende eritrociti, aggregati piastrinici, residui tissutali o cellule non ematopoietiche.

Figura 3. Questo diagramma a punti Side Scattering vs Scatter frontale mostra gli eventi nel gate Singlets (Singoletti). In questo diagramma sono esclusi i frammenti cellulari, che di solito hanno uno scatter frontale ridotto. Le cellule apoptotiche precoci denotano anche un side scattering leggermente aumentato, mentre le cellule apoptotiche in stadio avanzato e necrotiche denotano un side scattering diminuito in modo variabile. Le cellule vitali sono incluse nel gate Cells (Cellule).

Sommario > Nessuna anomalia immunofenotipica > Caso 1: Sangue intero normale

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Provetta per cellule M2

Figura 5. Questo diagramma a punti CD45 vs Side Scattering mostra gli eventi nel gate CD45+. Questo diagramma a punti consente di distinguere diverse popolazioni di globuli bianchi solitamente presenti nei campioni di sangue periferico, midollo osseo e linfonodi, inclusi i linfociti (gate Ly, in rosso), i monociti (gate Mo, in verde) e i granulociti (gate Gr, in blu). Il gate CD45dim (viola) copre l’area solitamente occupata dai mieloblasti e dalle cellule B immature. Anche i basofili, le cellule dendritiche plasmacitoidi, le cellule del plasma e le cellule NK possono rientrare in quest’area. Applicando colori diversi agli eventi compresi in ciascun gate, è possibile seguire le varie popolazioni durante l’analisi.

Figura 6. Questodiagramma apunti CD15 vs Side Scatteringmostra tutte le cellule vitali. Il CD15 è espresso sui granulociti (in blu) e a un livello inferiore sui monociti (in verde).

Figura 8. Questo diagramma a punti CD117 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD117 è espresso in modo variabile sui progenitori mieloidi positivi CD34, sui promielociti precoci e sui precursori eritroidi precoci, e a livello elevato sui mastociti. Il CD117 è espresso anche su sottopopolazioni di cellule NK reattive e cellule del plasma neoplastiche. Granulociti, monociti e linfociti maturi sono negativi per il CD117.

Figura 7. Questo diagramma a punti CD123 vs Side Scattering mostra tutte le cellule vitali. Il CD123 è espresso a livello elevato su basofili e cellule dendritiche plasmacitoidi e a un livello più basso su progenitori mieloidi positivi CD34 e monociti (in verde).

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