AOAC ERP Gluten Assays - Dec 2018

Prior to dilution, dissolve eventually formed crystals by incubating the buffer in a water bath  at 37 °C (99 °F). The diluted buffer is stable at 20 ‐ 25 °C (68 ‐77 °F) for four weeks.   9. Prepare cocktail/ethanol containing dilution buffer according to the instructions for use (see   remark under 9.1 and 9.2)  a) This buffer is only necessary in case a sample was measured with an OD > standard 6 and  needs to be diluted further  b) Mix 1% Cocktail (patented), 3% of an 80% ethanol solution, and 96% buffer e.g. 50 µl Cocktail  (patented), 150 µl 80% ethanol and 4800 µl buffer.    All three control samples and the 42 test samples should be extracted only once. First, extract the  control samples and run the ELISA test. Submit the result to the Study Director. Upon approval of the  control sample results, continue with the test samples. It is recommended to split the sample  extraction of the test samples into 2 stages: extract the samples 1‐21 and run ELISA test 1, then  extract the samples 22‐42 and run ELISA test 2  (see also plate layout data return sheet).  Please notice that this extraction procedure is slightly different from other gluten extraction  procedures using the Cocktail (patented) procedure.  a) Mix the sample vigorously e.g. with a spatula or by shaking prior to weighing in b) Check if the label on the extraction vials is hot‐water proof   c) Test if the water bath is at 50°C  d) Weigh in 1.00 g ± 0.02 g of sample into 50 ml vials   e) Add 10 ml of Cocktail (patented), close the vial and mix vigorously (vortex) to ensure a  homogenous suspension  f) Add 30 ml 80% ethanol, close the vial and mix vigorously (vortex)   g) Incubate at 50 °C (122 °F) for 40 min. Ensure that the water level of the water bath is  sufficient (see 6. c)   h) Take the vials out of the water bath and shake for 1 h up‐side‐down or by a rotator at room  temperature (20 ‐ 25 °C / 68 ‐77 °F)  i) Centrifuge for 10 min at least 2500 g, at room temperature (20 – 25 °C / 68 – 77 °F)  j) Filtrate the supernatant with a paper filter into a screw top vial  k) Dilute the extract 1+24 with ready‐to‐use buffer that is part of the test kit e.g. 40 µl of  extract + 960 µl of ready to use buffer. Use this diluted extract  immediately within 30 min  directly in the test, do not store it. The final dilution factor of the sample is thus 1000. 10. Sample Extraction Procedure 

4