Diagnóstico microbiológico

Diagnóstico de laboratorio  603

de ciertas pruebas diagnósticas. El empleo de herramientas diag- nósticas introducidas recientemente, tales como la PCR y las pruebas de antígenos urinarios, ha mejorado en gran medida la habilidad del laboratorista. 10,104

Además de las muestras ya mencionadas, se debe recolectar una muestra de orina (preferentemente la primera de la mañana) para enviarse a estudios serológicos. Se debe obtener una mues- tra sérica inicial de fase aguda como auxiliar de otras pruebas que hagan posible un diagnóstico más rápido. En esta muestra se de- berán buscar anticuerpos de IgM e IgG específicos para Legione- lla . La presencia de IgM específico para Legionella , con o sin IgG, orienta a una enfermedad aguda. Es probable que los anticuerpos no sean detectables en una etapa muy temprana de la enferme- dad, por lo cual se debe realizar un estudio de convalecencia si no se determinó la causa de infección. Los estudios serológicos son particularmente útiles en los pacientes que producen una cantidad mínima de esputo. 167 Desafortunadamente, el desarro- llo de valores diagnósticos de anticuerpos puede ser lento y no presentarse en el 75-80% de los pacientes en quienes se termina confirmando la enfermedad de los legionarios. 167 Además, algu- nos pacientes que presentan seroconversión se mantienen asinto- máticos; es probable que tuviesen una infección subclínica. Estudio directo de muestras clínicas Estudio macroscópico. El estudio macroscópico de las muestras de pulmón puede ayudar al patólogo a seleccionar las mejores áreas para el cultivo o estudio histológico. Se deben preparar frotis directos de exudados o preparados de improntas de material fresco de biopsia pulmonar. Los cortes por congelación de las muestras pulmonares también son útiles para el diagnóstico. Los cortes por congelación y los preparados de improntas deben colocarse en metanol para su fijación si se desea emplear tinción de Gram, hematoxilina y eosina, tinción de Giemsa, “Diff-Quik” o tinción ácido alcohol resistente modificada de Kinyoun. La tinción de Giemsa es útil para observar legionelas y otras bacterias en preparados frescos de improntas de material pulmonar o broncoscópico. Sin embargo, también debe realizarse una tinción de Gram por su utilidad para el diagnóstico diferencial. Estudio microscópico. La tinción de Gram puede utilizarse con distintas muestras (p. ej., aspirados transtraqueales, líquido pleural, aspirados de empiema torácico, punción pulmonar con aguja fina y preparados por improntas de material pulmonar). La fijación con metanol es mejor que la fijación con calor; asimismo, se puede mejorar la intensidad de la tinción aumentando el tiempo de tinción con safranina a 10 min o más. Como alternativa, la adición de carbolfucsina al 0.05% a la safranina mejora la intensidad de la tinción con la contratinción. La tinción de Gram-Weigert, “Diff-Quik” o Giemsa puede poner de manifiesto más microorganismos de los que se pueden ver con la tinción de Gram habitual. En los cortes histológicos embebidos en parafina y fijados con formol, no es posible ver fácilmente los microorganismos de Legionella en los preparados teñidos con hematoxilina y eosina, Gram, Brown-Brenn, Brown y Hopps o MacCallum-Goodpasture. La tinción de plata metenamina de Gomori y la tinción del ácido peryódico de Schiff no son útiles para observar legionelas. Una tinción ácido alcohol resistente modificada, como la realizada para las especies de Nocardia , es útil para demostrar L. micdadei . 117 Todas estas tinciones pueden realizarse tanto en frotis por impronta como en cortes tisulares, pero son más eficaces en frotis de gota fina. Un método histoquímico muy sensible para demostrar bacterias de todos los tipos es una de las tinciones de impregnación argéntica creada originalmente para espiroquetas. Al principio se utilizó una tinción de Dieterle

Selección, recolección y transporte de muestras clínicas

El amplio espectro clínico y la grave morbilidad y mortalidad de la enfermedad de los legionarios enfatizan la necesidad de realizar un diagnóstico de laboratorio rápido y preciso. Cuando se sospecha legionelosis clínicamente, se deben recoger muestras de las vías respiratorias bajas, tanto para cultivo como para prue- bas de anticuerpos fluorescentes directos (AFD). Las muestras apropiadas incluyen esputo obtenido por expectoración, mate- riales obtenidos por broncoscopia (p. ej., cepillado bronquial, biopsia, lavado [broncoalveolar]), aspirado transtraqueal, biop- sias pulmonares, aspirados de pulmón con aguja fina y líquido pleural. En la mayoría de los casos, es apropiado tomar cultivos para especies de Legionella sólo ante una solicitud específica. Sin embargo, es conveniente incluir las legionelas en el espectro de patógenos que se investigan cuando se cultiva tejido pulmonar y en aquellos obtenidos post mortem si no se determinó la causa de la muerte. Este cultivo de rutina puede servir como parte del sistema de advertencia de que estos patógenos asociados con el agua constituyen un problema en una institución particular. El aislamiento primario de las especies de Legionella en medios sólidos ha sido exitoso a partir de biopsias pulmona- res a tórax cerrado y a tórax abierto, líquido pleural, aspirados transtraqueales, muestras de lavado broncoalveolar y esputo. Se cuenta con un medio selectivo razonablemente semieficaz para el aislamiento primario de L. pneumophila en esputo y muestras bronquiales contaminadas. 40,42,167

Las muestras deben recolectarse de forma cuidadosa para evitar aerosoles y deben transportarse al laboratorio a tempe- ratura ambiente en recipientes estériles herméticos, preferi- blemente dentro de las primeras 2 h desde su recolección. Las muestras que deben enviarse al laboratorio de referencia deben refrigerarse o conservarse en hielo húmedo si se prevé una de- mora menor de dos días. Las muestras que se planeen almacenar durante días o semanas deberán mantenerse a una temperatura de − 70 °C o menor, las cuales pueden enviarse en hielo seco. Las muestras que deban remitirse a un laboratorio de referencia de- ben empaquetarse y enviarse de conformidad con las regulacio- nes federales ( véase el cap. 1). Si se remitirán sólo para estudio de patología y se fijan en formol neutro con amortiguador ( buffer ) antes de su envío, no es necesario refrigerarlas ni congelarlas du- rante el transporte. Las muestras que se remitan para análisis me- diante PCR deben manipularse de forma similar que para cultivo. En algunas ocasiones se ha aislado L. pneumophila de hemo- cultivos utilizando medios convencionales con suplemento de L-cisteína y pirofosfato férrico; en el pasado, esto se hacía uti- lizando medios aerobios y anaerobios radiométricos BACTEC® (Becton Dickinson Instrument Systems, Sparks, MD) sin su- plementos especiales. 48 El subcultivo a ciegas de los frascos para aerobios y anaerobios de BACTEC en BCYE parece ser necesario para el aislamiento de legionelas. Como se mencionó anteriormente, también se pueden encontrar legionelas (pocas veces) en sitios extrapulmonares. El valor práctico de buscar especies de Legionella en hemocultivos o sitios extrapulmona- res de forma rutinaria es bajo. Sin embargo, se debe conservar la posibilidad de realizar cultivos de sitios no respiratorios, en caso necesario. AMPLE