Diagnóstico microbiológico

604 CAPÍTULO 10 Legionella

modificada con la cual los microorganismos se tiñen de negro a café oscuro. Otras técnicas de impregnación argéntica, como los métodos de Steiner y Warthin-Starry, también funcionan y tiñen a los microorganismos de forma similar. Estas tinciones argénticas suelen realizarse en cortes histológicos. Aunque son sensibles, los granos de plata depositados en estas tinciones oscurecen la morfología bacteriana y, por supuesto, no se puede determinar la reacción de Gram. En las láminas 10-1 A , B y D se presenta la morfología de L. pneumophila. PCR de Legionella y otros métodos moleculares Al igual que con muchos otros microorganismos con requeri- mientos nutricionales especiales, la PCR y otras pruebas de am- plificación de ácidos nucleicos han mostrado tener una mayor sensibilidad que el cultivo para la detección de Legionella . Aun- que algunas pruebas se encuentran comercialmente disponibles, muchas otras son desarrolladas por los laboratorios. 76,125,128,158,165 La figura 10-2 muestra las curvas de amplificación de una PCR específica para L. pneumophila . Además, estas pruebas están dis- ponibles a través de laboratorios de referencia de alta calidad. Los estudios de Hayden y cols. 76 archivaron muestras de lava- dos broncoalveolares de pacientes con legionelosis confirmada mediante cultivo, tanto con PCR como con AFD. La sensibili- dad y especificidad de la PCR fue del 100%, mientras que para la prueba de AFD fue del 44 y 100%, respectivamente. Se revisa- ron las 22 345 pruebas para Legionella realizadas en la Cleveland Clinic durante un período de 4 años, las cuales incluyeron los resultados de una PCR específica para L. pneumophila , la prueba de antígeno urinario de Legionella y el cultivo de Legionella . Du- rante este lapso, hubo 20 pacientes con legionelosis confirmada por laboratorio, lo cual se concluyó en función de cuando menos dos de estas tres pruebas positivas. De estos pacientes, el 50% (10/20) resultaron positivos en todas las pruebas; el 45% fueron

negativos en el cultivo, aunque positivos en la PCR y el antígeno urinario de Legionella ; y el 5% (1/20) resultaron positivos sólo en la PCR y el cultivo. 28 En este contexto, la PCR fue la prueba más sensible, seguida de cerca por el antígeno urinario de Legio- nella ; el cultivo únicamente detectó un decepcionante 55% de los pacientes infectados. No se detectaron especies de Legionella distintas a L. pneumophila en este período. Pruebas de anticuerpos fluorescentes directos. Las pruebas de inmunofluorescencia directa, desarrolladas originalmente por Cherry y cols. 29 en los CDC, se han utilizado para la detección rápida de especies de Legionella en muestras clínicas de las vías respiratorias. En comparación con los cultivos, la prueba de AFD tiene baja sensibilidad (25-70%). 173 La especificidad ha sido elevada, pero en aquellos casos en los que existe una baja prevalencia de infección por Legionella , los resultados falsos positivos son inaceptablemente frecuentes. La prueba de AFD para L. pneumophila ha sido positiva en algunas personas saludables. 22 Además de las potenciales reacciones cruzadas inmunitarias, la contaminación con bacterias ambientales parece haber causado algunos resultados falsos positivos, incluso cuando se ejerce un cuidado escrupuloso al realizar la prueba. Por lo tanto, no se puede recomendar el uso de inmunofluorescencia para el diagnóstico directamente en muestras de pacientes. Aunque la inmunofluorescencia es un método útil, sólo lo es para la identificación de bacterias aisladas. Muchos provee- dores comercializan antisueros polivalentes conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC, de fluorescein isothiocya- nate ), así como sueros de control y otros reactivos para pruebas de AFD para Legionella . 46 Como nota de precaución, algunos conjugados monoclonales para AFD no pudieron detectar L. pneumophila en los tanques de almacenamiento de agua ca- liente o fría, ni en muestras de frotis de duchas y de un grifo de

20.0 18.0 16.0 14.0 12.0 10.0

■ ■ FIGURA 10-2  Esta curva de amplificación de PCR en tiempo real de una PCR específica para L. pneumophila demuestra que se detectan los 14 sero- tipos de L. pneumophila , mientras las especies distintas a L. pneumophila no se detectan en este análisis. 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 AMPLE L. pneumophila serogrupos 1-14 Legionella spp. distintas a pneumophila 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 − 2.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Número de ciclo Fluorescencia (F2/F1)