Diagnóstico microbiológico

Detección de Legionella en muestras clínicas  605

agua; 160 por lo tanto, no se puede recomendar para los estudios de AFD de agua potable u otras muestras de sistemas de agua artificiales. Los métodos de PCR son superiores para las prue- bas ambientales. Al realizar la prueba de AFD, los anticuerpos específicos en forma de antisuero polivalente marcado con isotiocianato de fluoresceína (conjugado) dirigido contra el/los antígeno(s) a ser detectados se adquieren de forma comercial. Se deben seguir las instrucciones del fabricante del reactivo de manera precisa. El antígeno (presente en la superficie de los microorganismos de Legionella o dentro de ellos) se fija sobre un portaobjetos y posteriormente se recubre con anticuerpos marcados con FITC. El antígeno se une al anticuerpo marcado con FITC y forma un complejo antígeno-anticuerpo. Este complejo no se elimina cuando se enjuaga suavemente con amortiguador. Cuando el/ los antígeno(s) de una especie de Legionella reaccionan con los anticuerpos conjugados con FITC, la exposición a la luz ultra- violeta hace que el FITC emita longitudes de onda de luz más largas en la región amarillo-verde del espectro de colores, y las bacterias se pueden observar (utilizando un microscopio de fluorescencia) como bacilos amarillo verdosos con fluorescen- cia brillante. Detección de antígenos de Legionella . Los procedi- mientos con el fin de detectar antígenos de Legionella en orina, desarrollados por Kohler y colegas 95 en el Indiana University Medical Center, incluyen el radioinmunoanálisis, el análisis de inmunoadsorción enzimática y la aglutinación de látex. Los inmunoanálisis comercialmente disponibles para la detección de antigenuria causada por el serogrupo 1 de L. pneumophila tienen una especificidad muy alta, cercana al 100%. Hay numerosos análisis de alta calidad en el mercado para la detección del antígeno de Legionella en la orina. Esta prueba es muy útil, particularmente para pacientes que no producen una cantidad suficiente de esputo. Se debe realizar en conjunto con la PCR o el cultivo para Legionella en todos los pacientes en quienes se sospeche legionelosis. La limitación más importante del análisis es la restricción a un único serogrupo, si bien es el patógeno humano más frecuente en el género. Otra limitación potencial es la excreción prolongada del antígeno en algunos pacientes, lo cual puede durar hasta un año. En particular, los pacientes inmunodeprimidos que tienen una resolución tardía de la fiebre probablemente excreten el antígeno durante más de 60 días. 142 Por lo tanto, la detección de antígeno urinario debe correlacionarse cuidadosamente con la historia clínica y otros hallazgos de laboratorio y radiológicos antes de señalar que la infección actual es causada por Legionella . 94 También se han descrito reacciones cruzadas ocasionales entre los serogrupos de L. pneumophila . 93

de forma rutinaria a partir de la microflora normal de las vías respiratorias superiores. El medio sólido no selectivo que se recomienda para el ais- lamiento de legionelas es el BCYE, el cual contiene l-cisteína, pirofosfato férrico, amortiguador ACES, ácido α-cetoglutárico y carbón activado. Está comercialmente disponible con va- rios fabricantes. Además del agar BCYE, se debe considerar el uso de uno o más medios selectivos para evitar el sobrecreci- miento de microflora habitual. Se han agregado antibióticos a la base del agar BCYE, lo que lleva a medios selectivos razona- blemente eficaces. Un medio selectivo útil contiene una base de BCYE complementada con cefamandol, polimixina B y aniso- micina, al cual se le conoce como BMPA . Otra opción contiene glicina, vancomicina, polimixina B y anisomicina, a la cual se le denomina medio de Wadowsky-Yee modificado o medio de MWY . El cefamandol en la modificación anterior puede inhibir las es- pecies de Legionella que no producen β-lactamasa, mientras el medio de MWY no es tan selectivo como el agar de BMPA. Los medios selectivos con base de BCYE se encuentran ampliamente disponibles. Como los medios selectivos pueden inhibir algunas legionelas, se les debe utilizar junto con agar BCYE no selectivo. Muestras tisulares. Para inocular los medios BCYE o BMPA, el tejido fresco de pulmón debe aplicarse suavemente (con un toque) en el primer cuadrante, con un asa de inoculación estéril para transferir este inóculo a los otros cuadrantes para su aislamiento primario. Como alternativa, se puede utilizar un molinillo tisular estéril para homogeneizar trozos de 1-2 mm de tejido picado en 0.5-1 mL de un caldo estéril, como el caldo tripticasa de soya (soja) o un medio de tioglicolato enriquecido. Después de la homogeneización, se inocula el medio de siembra con alrededor de 0.1mL del homogeneizado y se siembra en estría para su aislamiento. Además, se deben preparar portaobjetos para tinción de Gram de la misma muestra. Líquido pleural y aspirados transtraqueales. El lí- quido pleural y los aspirados transtraqueales se siembran de forma directa en medios selectivos y no selectivos, como se hace para los homogeneizados tisulares. Las placas de BCYE o BMPA se incuban en una incubadora con CO 2 al 5-10% a 35 °C, y se les observa diariamente durante cinco días; se les puede seguir observando cada 2-3 días hasta durante dos semanas. Se inoculan otros medios para las muestras de las vías respiratorias bajas (p. ej., agar sangre de carnero, agar chocolate y agar de MacConkey) y se incuban de la forma convencional. Posteriormente, se procesa la misma muestra utilizada para el cultivo mediante un frotis para la tinción de Gram. Procedimiento de descontaminación mediante la- vado ácido. Los medios selectivos que actualmente están disponibles para el aislamiento primario de legionelas no son del todo selectivos, por lo que permiten el crecimiento concomitante de algunas otras bacterias (p. ej., especies de Bacillus o de Pseudomonas ). Además, el crecimiento de legionelas en BCYE puede inhibirse por acción de otras bacterias en las muestras clínicas, incluso cuando se incorporan antibióticos a los medios selectivos. Se ha informado que el aislamiento de Legionella puede mejorarse mediante el tratamiento de las muestras respiratorias contaminadas, como esputo, lavados bronquiales, lavados broncoalveolares y aspirados traqueales, con una solución de lavado ácido antes de la inoculación en placas de BCYE y BMPA. 25 Se puede utilizar el procedimiento explicado en el protocolo 10-1 para el procesamiento de las muestras que contienen microflora habitual. El uso del procedimiento

Detección de Legionella en muestras clínicas Aislamiento de especies de Legionella en muestras clínicas AMPLE El cultivo bacteriológico de Legionella es un método utilizado en muchos laboratorios para diagnosticar legionelosis. 176 Aunque el cultivo es 1.5-3 veces más sensible que la prueba de AFD, es me- nos sensible que los métodos de PCR y las pruebas de antígeno urinario de Legionella . Por lo general, el cultivo de las especies de Legionella es clí- nicamente importante debido a que estas bacterias no se aíslan