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COMBINAISONS D’ANTICORPS CE POUR L’ANALYSE DE LA LEUCÉMIE / DU LYMPHOME* P ANELS C LEAR LL AB 10C

RECUEIL

Chaque événement compte * Lymphome non hodgkinien uniquement

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Beckman Coulter • Panels ClearLLab 10C • C33350 AB

TABLE DES MATIÈRES

INTRODUCTION................................................................................3 CONTEXTE..........................................................................................3 RECOMMANDATIONS CONSENSUELLES POUR L’IMMUNOPHÉNOTYPAGE............................................................. 4 UTILISATION PRÉVUE DES PANELS CLEARLLAB 10C........... 4 PANELS CLEARLLAB 10C.............................................................. 4 KIT DE COMPENSATION CLEARLLAB........................................ 5 CHOIX ET INTERPRÉTATION DES CAS....................................... 5 DOCUMENTS CONNEXES.............................................................. 6 RÉFÉRENCES.................................................................................... 6 CAS.......................................................................................................7 PAS D’ANOMALIE IMMUNOPHÉNOTYPIQUE.............................7 SANG TOTAL PÉRIPHÉRIQUE :...................................................... 7 Cas nº 1 : Sang entier normal........................................................... 7 MOELLE OSSEUSE............................................................................32 Cas nº 2 : Moelle osseuse normale.............................................32 GANGLION LYMPHATIQUE............................................................56 Cas nº 3 : Ganglion lymphatique normal.................................56 PROCESSUS NÉOPLASIQUES À PARTIR DES CELLULES B............................................................................80 LEUCÉMIE LYMPHOBLASTIQUE B/LYMPHOME LYMPHOBLASTIQUE....................................................................... 80 Cas nº 4 : Leucémie aiguë lymphoblastique B/lymphome lymphoblastique................................................... 80 LEUCÉMIE LYMPHOBLASTIQUE B/LYMPHOME LYMPHOBLASTIQUE......................................................................105 Cas nº 5 : Leucémie aiguë lymphoblastique B/lymphome lymphoblastique..................................................105 LEUCÉMIE LYMPHOÏDE CHRONIQUE/PETIT LYMPHOME LYMPHOCYTAIRE...................................................130 Cas nº 6 : Leucémie lymphoïde chronique/petit lymphome lymphocytaire.............................................................130 LEUCÉMIE LYMPHOÏDE CHRONIQUE/PETIT LYMPHOME LYMPHOCYTAIRE................................................... 154 Cas nº 7 : Leucémie lymphoïde chronique/petit lymphome lymphocytaire.............................................................154 LYMPHOME À CELLULES DU MANTEAU............................... 178 Cas nº 8 : Lymphome à cellules du manteau...................... 178 MYÉLOME PLASMOCYTAIRE..................................................... 202 Cas nº 9 : Myélome plasmocytaire..........................................202 LYMPHOME FOLLICULAIRE....................................................... 226 Cas nº 10 : Lymphome folliculaire............................................226

LYMPHOME À CELLULES B DU CENTRE GERMINATIF.....................................................................................250 Cas nº 11 : Lymphome à cellules B du centre germinatif............................................................................................250 LYMPHOME À CELLULES B MATURES...................................274 Cas nº 12 : Lymphome à cellules B matures........................ 274 LYMPHOME À CELLULES B MATURES.................................. 298 Cas nº 13 : Lymphome à cellules B matures........................298 PROCESSUS NÉOPLASIQUE DU CENTRE DE CELLULES T...................................................................................322 LEUCÉMIE LYMPHOBLASTIQUE T/LYMPHOME LYMPHOBLASTIQUE......................................................................322 Cas nº 14 : Leucémie lymphoblastique T/Lymphome lymphoblastique T........................................................................... 322 LEUCÉMIE LYMPHOBLASTIQUE T/LYMPHOME LYMPHOBLASTIQUE.....................................................................346 Cas nº 15 : Leucémie lymphoblastique T/Lymphome lymphoblastique T...........................................................................346 LYMPHOME À GRANDS LYMPHOCYTES GRANULEUX T................................................................................. 370 Cas nº 16 : Trouble lymphoprolifératif à cellules T...........370 LYMPHOME À GRANDS LYMPHOCYTES GRANULEUX T.................................................................................394 Cas n o 17 : Trouble lymphoprolifératif à cellules T............394 PROCESSUS NÉOPLASIQUE D’ORIGINE MYÉLOÏDE...........418 LEUCÉMIE MYÉLOÏDE AIGUË..................................................... 418 Cas n o 18 : Leucémie myéloïde aiguë......................................418 LEUCÉMIE MYÉLOÏDE AIGUË....................................................442 Cas n o 19 : Leucémie monocytaire aiguë..............................442 LEUCÉMIE MYÉLOÏDE AIGUË....................................................466 Cas nº 20 : Leucémie myéloïde aiguë, NOS........................466 LEUCÉMIE MYÉLOÏDE AIGUË....................................................490 Cas nº 21 : Leucémie promyélocytaire aiguë..................... 490 LEUCÉMIE MYÉLOÏDE AIGUË..................................................... 514 Cas nº 22 : Leucémie monocytaire aiguë..............................514 SYNDROME MYÉLODYSPLASIQUE......................................... 538 Cas n o 23 : Syndrome myélodysplasique.............................538 SYNDROME MYÉLODYSPLASIQUE......................................... 562 Cas n o 24 : Syndrome myélodysplasique.............................562

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INTRODUCTION Ce recueil a été conçu pour vous aider dans l’analyse des données d’immunophénotypage du cytomètre en flux générées en utilisant les réactifs marqués CE-IVD (diagnostic in vitro) dans les panels du ClearLLab 10C de Beckman Coulter pour l’analyse de la leucémie et du lymphome, sur les cytomètres en flux Navios et Navios EX de Beckman Coulter. Il contient des études de cas présentant les résultats caractéristiques typiques de différentes tumeurs lymphoïdes et myéloïdes, tout comme les cas de patients dont les résultats cliniques et/ou de laboratoire suggèrent un processus néoplasique sous-jacent, mais chez lesquels aucune anomalie d’immunophénotypage n’est identifiée. Parmi les types d’échantillons, on retrouve : du sang total périphérique, de la moelle osseuse et des ganglions lymphatiques. Chaque cas comporte une vignette clinique qui décrit les antécédents cliniques et les données démographiques du patient, les fichiers de données en mode liste spécifiques au cas pour les nouvelles analyses effectuées par l’utilisateur de ce recueil, des protocoles d’analyses spécifiques au ClearLLab 10C à utiliser avec les données en mode liste, et un compte rendu affichant les analyses avec le protocole fourni. Chaque compte rendu comprend des remarques relatives aux analyses qui donnent des précisions sur les découvertes d’immunophénotypage ainsi que sur les dangers potentiels. REMARQUE : les exemples de recueils sont fournis seulement à des fins d’illustration. Toutes les catégories de tumeurs hématolymphoïdes ne sont pas présentées, tout comme les variantes possibles d’immunophénotypage ne sont pas toutes décrites ou indiquées. CONTEXTE L’immunophénotypage par cytométrie en flux évalue la présence et l’absence d’antigènes spécifiques pour chaque cellule individuelle présente dans l’échantillon. Considérés dans leur ensemble, ces résultats génèrent un profil immunophénotypique pour chaque cellule, qui peut être soit cohérent avec une population attendue (c’est-à-dire normal), soit incohérent avec une population attendue (c’est-à-dire aberrant) dans ce type d’échantillon. Lors de l’analyse d’échantillons de patients avec suspicion de malignités hémato-lymphoïdes, plusieurs étapes sont nécessaires 1 :

• Évaluation de toutes les populations cellulaires présentes dans l’échantillon.

• Évaluation de chaque population cellulaire comme « normale » ou « aberrante ».

• Caractérisation détaillée de la population aberrante en fonction de la présence ou de l’absence d’antigènes, ainsi que de l’intensité augmentée ou réduite de la coloration par des anticorps marqués par des fluorochromes. • Interprétation d’un immunophénotype aberrant, prenant en compte, le cas échéant, les informations complémentaires comme les antécédents cliniques, l’histologie, la cytologie, l’immunohistochimie, et les études de génotypage comme l’hybridation in situ, le caryotypage et les diagnostics moléculaires.

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RECOMMANDATIONS CONSENSUELLES POUR L’IMMUNOPHÉNOTYPAGE Au cours des deux dernières décennies, des recommandations consensuelles ont été adoptées pour l’immunophénotypage par cytométrie en flux d’échantillons de patients présentant des malignités hémato-lymphoïdes suspectées ou connues. Plusieurs directives ont été publiées dans la littérature scientifique. L’immunophénotypage par cytométrie en flux a été introduit dans la classification OMS des tumeurs des tissus hématopoïétiques et lymphoïdes depuis 2008 2 . Les indications médicales et la validation des études de cytométrie en flux, comprenant les détails de tests pré- analytiques, analytiques et post-analytiques, sont traitées dans les Bethesda International Consensus Conference recommendations 3,4,5 de 2006, et dans ICSH/ICCS practice guidelines for cell-based fluorescence assays 6,7,8 . UTILISATION PRÉVUE DES PANELS ClearLLab 10C Les panels ClearLLab 10C sont destinés au diagnostic in vitro et servent à l’identification qualitative de populations cellulaires par immunophénotypage multiparamétrique réalisé avec les cytomètres en flux Navios et Navios EX. Ces réactifs sont utilisés pour faciliter le diagnostic différentiel de patients anormaux sur le plan hématologique qui présentent, ou chez qui l’on suspecte l’une des néoplasies hématopoïétiques suivantes : leucémie chronique, leucémie aiguë, lymphome non hodgkinien, myélome, syndrome myélodysplasique (MDS) et/ou syndrome myéloprolifératif (MPN). Les réactifs peuvent être utilisés dans des échantillons de sang total périphérique (recueilli dans du K 2 EDTA, de l’acide-citrate-dextrose [ACD] ou de l’héparine), de moelle osseuse (recueillie dans du K 2 EDTA, de l’ACD ou de l’héparine) et de ganglion lymphatique. Un pathologiste ou un professionnel équivalent doit confirmer l’interprétation des résultats en s’appuyant sur d’autres résultats cliniques et de laboratoire.

Ces réactifs offrent des résultats qualitatifs multiparamétriques pour les antigènes de surface listés ci-dessous :

Panels ClearLLab 10C

Laser bleu

Laser rouge

Laser violet

APC- A750 PB KRO

Réf.

Tube

FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC- A700

B96805 Tube de cellules B

Kappa Lambda CD10 CD5 CD200 CD34 CD38 CD20 CD19 CD45

B96806 Tube de cellules T

CD4

CD2 CD56 CD5 CD34 CD7

CD8

CD3 CD45

TCR γδ

B96807 Tube de

CD16

CD7

CD10 CD13 CD64 CD34 CD14 HLA-DR CD11b CD45

cellules M1

B96808 Tube de

CD15

CD123 CD117 CD13 CD33 CD34 CD38 HLA-DR CD19 CD45

cellules M2

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KIT DE COMPENSATION ClearLLab

Laser bleu

Laser rouge

Laser violet

APC- A750 PB KRO

Réf.

FITC

PE

ECD PC5.5

PC7

APC APC- A700

B74074

CD4

CD4

CD3

CD4

CD4

CD4

CD4

CD4

CD4

CD8

Le réactif ci-dessus est fourni dans un format normalisé, il s’utilise avec des réactifs pour la préparation des échantillons et la configuration du cytomètre, ainsi que le logiciel pour l’acquisition des données et l’analyse. Les panels ClearLLab 10C sont conformes aux recommandations pour la normalisation décrites dans les directives Bethesda 2 . Des informations complémentaires sur les panels ClearLLab 10C sont disponibles sur beckman.com/ClearLLab . CHOIX ET INTERPRÉTATION DES CAS Les données présentées dans ce recueil ont été générées en suivant la procédure détaillée dans le mode d’emploi des panels ClearLLab 10C disponible sur beckman.com . Les cas représentatifs ont été choisis parmi des données d’études cliniques et ils ont été examinés, annotés et interprétés par :

Dr Brent Wood Professeur, biologie médicale et pathologie Chef de service, hématopathologie Directeur, laboratoire d’hématopathologie et pathologie du SCCA Directeur médical, laboratoires SCCA Laboratories Université de Washington, Seattle, WA, É.-U.

Dr Xueyan Chen, Professeure adjointe, biologie médicale Directrice adjointe, laboratoire d’hématopathologie Université de Washington, Seattle, WA

Dr Yi Zhou Professeur adjoint Département de biologie médicale Université de Washington, Seattle, WA

Protocoles d’analyse : Téléchargez le protocole d’analyse ClearLLab 10C. Analyse : Téléchargez les fichiers d’analyse Kaluza C spécifiques aux cas.

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RÉFÉRENCES 1. Flow Cytometric Immunophenotyping for Hematologic Neoplasms. F.E. Craig, K.A. Foon. Blood. 2008 ; 111; 3941-3967. 2. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe EA, Pileri SA, Stain H, Thiele J, & Vardiman JW (eds) (2008) WHO Classification of Tumors of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. IARC Press : Lyon 3. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Swerdlow SH, et al. Blood. 2016;127:2375-90. 4. The 2016 revision of the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Arber DA, et al. Blood 2016 127:2391-2405. 5. 2006 Bethesda International Consensus recommendations on the immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasia by flow cytometry: optimal reagents and reporting for the flow cytometric diagnosis of hematopoietic neoplasia. Wood BL, Arroz M, Barnett D, DiGiuseppe J, Greig B, Kussick SJ, Oldaker T, Shenkin M, Stone E, Wallace P. Cytometry B Clin Cytom. 2007;72 Suppl 1:S14-22 6. 2006 Bethesda International Consensus recommendations on the flow cytometric immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasia: medical indications. Davis BH, Holden JT, Bene MC, Borowitz MJ, Braylan RC, Cornfield D, Gorczyca W, Lee R, Maiese R, Orfao A, Wells D, Wood BL, Stetler-Stevenson M. Cytometry B Clin Cytom. 2007;72 Suppl 1:S5-13 7. 2006 Bethesda International Consensus Conference on Flow Cytometric Immunophenotyping of Hematolymphoid Neoplasia. Stetler-Stevenson M, Davis B, Wood B, Braylan R. Cytometry B Clin Cytom. 2007;72 Suppl 1:S3 8. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS - part III - analytical issues. Tanqri S, Vall H, Kaplan D, Hoffman B, Purvis N, Porwit A, Hunsberger B, Shankey TV; ICSH/ICCS Working Group. Cytometry B Clin Cytom. 2013 Sep-Oct;84(5):291-308. doi: 10.1002/cyto.b.21106 9. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS - part IV - postanalytic considerations. Barnett D, Louzao R, Gambell P, De J, Oldaker T, Hanson CA; ICSH/ICCS Working Group. Cytometry B Clin Cytom. 2013 Sep-Oct;84(5):309-14. doi: 10.1002/cyto.b.21107 10. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS - part V - assay performance criteria. Wood B, Jevremovic D, Béné MC, Yan M, Jacobs P, Litwin V; ICSH/ICCS Working Group. Cytometry B Clin Cytom. 2013 Sep-Oct;84(5):315-23. doi: 10.1002/cyto.b.2110 • ClearLLab Compensation Kit Instructions For Use (Mode d’emploi du kit de compensation ClearLLab), Réf. B74074 • ClearLLab Control Cells Instructions For use (Mode d’emploi des cellules de contrôle ClearLLab), Réf. B99884 • ClearLLab Control Cells QC Analysis Protocols Download Addendum (Addendum pour télécharger le protocole d’analyse de CQ des cellules de contrôle ClearLLab), Réf. C33258AA DOCUMENTS CONNEXES • ClearLLab 10C Application System Guide (Guide du système de l’Application ClearLLab 10C), Réf. C28516AA • Kaluza C Flow Cytometry Software Instructions for Use (Mode d’emploi pour le logiciel du cytomètre en flux Kaluza C), Réf. C20151 • Navios Flow Cytometer Instructions For Use (Mode d’emploi du cytomètre en flux Navios), Réf. 774530 • Navios EX Flow Cytometer Instructions For Use (Mode d’emploi du cytomètre en flux Navios EX), Réf. B77109AA • ClearLLab 10C Panels Instructions For Use (Mode d’emploi des panels ClearLLab 10C), Réf. C00197 • ClearLLab Compensation Beads Instructions For Use (Mode d’emploi des gouttes pour la compensation ClearLLab), Réf. C00201

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CAS

La hiérarchie des couleurs dans les fenêtres est appliquée aux cas :

Lymphocytes (Fenêtre Ly)/cellules NK : rouge Cellules B CD19+ : orange Cellules T CD3+ : bleu turquoise

Monocytes (Fenêtre Mo) : vert Granulocytes (Fenêtre Gr) : bleu

CD45dim : violet Populations aberrantes supplémentaires : bleu-vert Population CD45 négative : gris

PAS D’ANOMALIE IMMUNOPHÉNOTYPIQUE La cytométrie en flux est un moyen de caractériser les populations de leucocytes. Cela peut contribuer au diagnostic différentiel de patients anormaux sur le plan hématologique qui ont, ou chez qui l’on suspecte, une néoplasie hématopoïétique, y compris une leucémie chronique, une leucémie aiguë, un lymphome non hodgkinien, un myélome, un syndrome myélodysplasique (MDS) et/ou un syndrome myéloprolifératif (MPN). Un élément crucial pour l’identification des populations aberrantes dans ces situations cliniques est la familiarité avec les populations cellulaires normales présentes dans le sang total, la moelle osseuse et les échantillons de ganglion lymphatique. Voici des exemples d’échantillons normaux colorés avec les panels ClearLLab 10C.

SANG TOTAL PÉRIPHÉRIQUE : Cas nº 1 : Sang entier normal

Vignette clinique

Ce patient de sexe masculin, âgé de 65 ans, présente une thrombocytopénie. Un échantillon de sang total périphérique est soumis à un immunophénotypage par cytométrie en flux à l’aide des panels ClearLLab 10C. Immunophénotypage par cytométrie en flux

Tube de cellules B

Figure 1 : Ce graphe biparamétrique TIME (Temps) en fonction de CD45 est non conditionné et montre tous les événements collectés de manière séquentielle. Ce graphe vise à évaluer la perturbation fluidique lors de l’acquisition des échantillons. Une acquisition stable est représentée par une disposition uniforme des événements au fil du temps. Les événements qui s’écartent du modèle stable peuvent être exclus dans la fenêtre Time (Temps).

Figure 2 : Ce graphe biparamétrique FS INT en fonction de FS PEAK montre les événements dans la fenêtre Time (Temps). Ce graphe vise à exclure les doublons de cellules ou les agrégats. Les événements de singulets présentent une relation linéaire pour INT en fonction de PEAK et sont inclus dans la fenêtre Singlets (Singulets), tandis que les doublons se trouvent en dehors de la relation linéaire.

Table des matières > Pas d’anomalie immunophénotypique > Cas nº 1 : Sang entier normal

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Tube de cellules B

Figure 3 : Ce graphe biparamétrique Side Scatter (Diffusion orthogonale) en fonction de Forward Scatter (Diffusion axiale) montre les événements dans la fenêtre Singlets (Singulets). Ce graphe vise à exclure les débris cellulaires, qui ont généralement une diffusion axiale réduite. Les cellules apoptotiques précoces présentent également une diffusion orthogonale légèrement accrue, tandis que les cellules apoptotiques et nécrotiques tardives ont une diffusion orthogonale réduite, de façon variable. Les cellules viables sont incluses dans la fenêtre Cells (Cellules).

Figure 4 : Ce graphe biparamétrique CD45 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre les événements dans la fenêtre Cells (Cellules). Ce graphe vise à mettre en évidence diverses sous-populations de globules blancs conditionnées par la fenêtre CD45 positive. La population CD45 négative comprend généralement des globules rouges, des agrégats de plaquettes, des débris de tissus ou des cellules non hématopoïétiques.

Figure 5 : Ce graphe biparamétrique CD45 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale)montre lesévénementsdans lafenêtreCD45+.Cegraphebiparamétrique permet de distinguer plusieurs populations de globules blancs que l’on trouve généralement dans les échantillons de sang périphérique, de moelle osseuse et de ganglions lymphatiques, notamment les lymphocytes (fenêtre Ly, en rouge/ orange), les monocytes (fenêtre Mo, en vert) et les granulocytes (fenêtre Gr, en bleu). La fenêtre CD45dim (en violet) couvre la zone habituellement occupée par les progéniteurs précoces, c’est-à-dire les myéloblastes et les cellules B immatures. Des basophiles, des cellules dendritiques plasmacytoïdes, des plasmocytes et des cellules NK peuvent également apparaître dans cette zone. En appliquant différentes couleurs aux événements compris dans chaque fenêtre, il est possible d’identifier les différentes populations tout au long de l’analyse.

Figure 6 : Ce graphe biparamétrique CD19 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre les événements dans la fenêtre Cells (Cellules). La fenêtre CD19+ identifie les cellules CD19 positives. Le CD19 est exprimé sur les cellules B matures et immatures, ainsi que sur la plupart des plasmocytes. Ces cellules présentent généralement une diffusion orthogonale faible à modérée.

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Tube de cellules B

Figure 7 : Ce graphe biparamétrique kappa en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. La chaîne légère kappa de surface est exprimée sur les cellules B matures (en orange) et les cellules B immatures au stade tardif. La proportion de cellules B kappa positives est normalement supérieure à celle des cellules B kappa négatives (lambda positives). La positivité kappa apparente est observée sur les monocytes (en vert), en raison de la liaison de l’immunoglobuline par les récepteurs Fc. Les cellules positives de la chaîne légère kappa sont présentées sur le côté droit du graphe.

Figure 8 : Ce graphe biparamétrique Lambda en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale)montre toutes les cellules viables. La chaîne légère lambda de surface est exprimée sur les cellules B matures (en orange) et les cellules B immatures au stade tardif. La proportion de cellules B lambda positives est normalement inférieure à celle des cellules B lambda négatives (kappa positives). La positivité lambda apparente est observée sur lesmonocytes (en vert), en raison de la liaison de l’immunoglobuline par les récepteurs Fc. Les cellules positives de la chaîne légère lambda sont présentées sur le côté droit du graphe.

Figure 9 : Ce graphe biparamétrique CD10 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD10 est exprimé sur les cellules B immatures, les cellules Bmatures du centre germinatif et les granulocytesmatures (en bleu). Les granulocytes présentent une diffusion orthogonale élevée, contrairement aux cellules lymphoïdes qui présentent une faible diffusion orthogonale.

Figure 10 : Ce graphe biparamétrique CD5 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD5 est exprimé sur les cellules T matures et immatures (en rouge, en bas à droite) et faiblement exprimé sur une sous- population de cellules B matures (en orange). Ces cellules lymphoïdes présentent généralement une diffusion orthogonale faible.

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Tube de cellules B

Figure 11 : Ce graphe biparamétrique CD200 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD200 est généralement exprimé sur les cellules B, mais est négatif dans certaines cellules B néoplasiques. Il est particulièrementutilepourdistinguer le lymphomeàcellulesdumanteau(généralement CD200négatif)de la leucémie lymphoïdechronique/dupetit lymphome lymphocytaire (généralement CD200 positif).

Figure 12 : Ce graphe biparamétrique CD34 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD34 est un marqueur des progéniteurs hématopoïétiques précoces. Il est exprimé sur les cellules souches hématopoïétiques, les progéniteursmyéloïdes précoces (myéloblastes) et les cellules B et T immatures (lymphoblastes). Les granulocytes matures, les monocytes et les lymphocytes sont négatifs pour le CD34. Les progéniteurs CD34 positifs représentent normalementmoins de 0,01 %des globules blancs contenus dans le sangpériphérique.

Figure 13 : Ce graphe biparamétrique CD38 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale)montre toutes les cellules viables. Le CD38 est unmarqueur d’activation. Il est exprimé au niveau le plus élevé sur les plasmocytes, à un niveau modéré sur les progéniteursmyéloïdes et lymphoïdes immatures, à un niveau faible sur lesmonocytes (en vert) et à un niveau variable sur les lymphocytes matures activés.

Figure 14 : Ce graphe biparamétrique CD20 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD20 est exprimé sur les cellules B matures (en orange) et à un niveau variable sur une sous-population de cellules T matures. Il est exprimé de manière variable sur les cellules B immatures plus tardives. Les cellules CD20 positives se trouvent généralement dans la fenêtre Lymphocyte avec une faible diffusion orthogonale.

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Tube de cellules B

Figure 15. Ce graphe biparamétrique Lambda en fonction de Kappa montre toutes les cellules CD19+. Les cellules B immatures précoces (en violet) n’expriment pas de chaînes légères d’immunoglobuline de surface, c’est-à-dire qu’elles sont négatives pour la chaîne légère kappa ou lambda. Les cellules B matures sont polyclonales, exprimant la chaîne légère kappa ou lambda. Le rapport kappa/lambda normal est de 1,4 avec des valeurs comprises entre 1 et 2. Il est fréquent d’observer des valeurs résiduelles attribuées à l’immunoglobuline plasmatique adhérente.

Figure 16. Ce graphe biparamétrique CD19 en fonction de CD20 montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). Les cellules B matures expriment à la fois le CD19 et le CD20 (en orange). Certaines cellules B néoplasiques peuvent présenter une expression réduite de CD19 ou de CD20.

Figure 17. Ce graphe biparamétrique CD19 en fonction de CD10 montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). Les cellules B sont CD19positives (enorange). Les cellules B matures CD10 positives sont réparties dans les centres germinatifs des ganglions lymphatiques et une petite sous-population de cellules B immatures au stade tardif est présente dans le sang périphérique et les échantillons de moelle osseuse prélevés par aspiration.

Figure 18. Ce graphe biparamétrique CD38 en fonction de CD10 montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). Le CD38 est exprimé au niveau le plus élevé sur les plasmocytes, à un niveau modéré sur les cellules B immatures et à un niveau faible sur les cellules B des centres germinatifs. La plupart des cellules B matures (en orange) montrent une expression de CD38 faible à absente. Les cellules T (en rouge) présentent une expression variable de CD38 en fonction de l’état d’activation.

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Tube de cellules B

Figure 19. Ce graphe biparamétrique CD20 en fonction de CD10 montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). La plupart des cellules Bmatures expriment le CD20 uniformément, à un niveau élevé, sans CD10.

Figure 20. Ce graphe biparamétrique CD19 en fonction de CD5 montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). Le CD5 est exprimé sur les cellules T (en rouge, en haut à gauche), de manière variable à un faible niveau sur une sous- population de cellules B matures normales (en orange) et sur certains sous-types de cellules B néoplasiques.

Figure 22. Ce graphe biparamétrique CD5 en fonction de CD200 montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). La plupart des cellules Bmatures expriment normalement le CD200 avec une sous-population exprimant le CD5 de manière variable. Les cellules B néoplasiques de la leucémie lymphoïde chronique/du petit lymphome lymphocytaire expriment généralement le CD5 et le CD200, tandis que le lymphome à cellules du manteau exprime généralement le CD5, mais pas le CD200.

Figure 21. Ce graphe biparamétrique CD20 en fonction de CD200 montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). La plupart des cellules B matures (en orange) expriment le CD200 à un niveau faible à modéré.

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Tube de cellules T

Figure 1 : Ce graphe biparamétrique TIME (Temps) en fonction de CD45 est non conditionné et montre tous les événements collectés de manière séquentielle. Ce graphe vise à évaluer la perturbation fluidique lors de l’acquisition des échantillons. Une acquisition stable est représentée par une disposition uniforme des événements au fil du temps. Les événements qui s’écartent du modèle stable peuvent être exclus dans la fenêtre Time (Temps).

Figure 2 : Ce graphe biparamétrique FS INT en fonction de FS PEAK montre les événements dans la fenêtre Time (Temps). Ce graphe vise à exclure les doublons de cellules ou les agrégats. Les événements de singulets présentent une relation linéaire pour INT en fonction de PEAK et sont inclus dans la fenêtre Singlets (Singulets), tandis que les doublons se trouvent en dehors de la relation linéaire.

Figure 3 : Ce graphe biparamétrique Side Scatter (Diffusion orthogonale) en fonction de Forward Scatter (Diffusion axiale) montre les événements dans la fenêtre Singlets (Singulets). Ce graphe vise à exclure les débris cellulaires, qui ont généralement une diffusion axiale réduite et une diffusion orthogonale élevée. Les cellules apoptotiques précoces présentent également une diffusion orthogonale légèrement accrue, tandis que les cellules apoptotiques et nécrotiques tardives ont une diffusion orthogonale réduite,defaçonvariable.Lescellulesviablessont inclusesdans lafenêtreCells(Cellules).

Figure 4 : Ce graphe biparamétrique CD45 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre les événements dans la fenêtre Cells (Cellules). Ce graphe vise à mettre en évidence divers types de globules blancs CD45 positifs. La population CD45 négative comprend généralement des globules rouges, des agrégats de plaquettes ou des cellules non hématopoïétiques.

Table des matières > Pas d’anomalie immunophénotypique > Cas nº 1 : Sang entier normal

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Tube de cellules T

Figure 5 : Ce graphe biparamétrique CD45 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale)montre lesévénementsdans lafenêtreCD45+.Cegraphebiparamétrique permet de distinguer plusieurs populations de globules blancs que l’on trouve généralement dans les échantillons de sang périphérique, de moelle osseuse et de ganglions lymphatiques, notamment les lymphocytes (fenêtre Ly, en rouge/bleu turquoise), les monocytes (fenêtre Mo, en vert) et les granulocytes (fenêtre Gr, en bleu). La fenêtre CD45dim (en violet) couvre la zone habituellement occupée par les myéloblastes et les cellules B immatures. Des basophiles, des cellules dendritiques plasmacytoïdes,desplasmocytesetdescellulesNKpeuventégalementapparaîtredans cette zone. En appliquant différentes couleurs aux événements compris dans chaque fenêtre, il est possible de suivre les différentes populations tout au long de l’analyse.

Figure 6 : Ce graphe biparamétrique CD3 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. La fenêtre CD3+ identifie les cellules avec expression de CD3 de surface (en bleu turquoise). Le CD3 est hautement spécifique des cellules T, étant exprimé uniquement à la surface des cellules Tmatures et des cellules T immatures plus tardives. Ces cellules présentent généralement une diffusion orthogonale faible à modérée.

Figure 8 : Ce graphe biparamétrique CD4 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD4 est exprimé sur une sous- population de cellules T matures et immatures à un niveau élevé (en bleu turquoise). Le CD4 est également exprimé sur les monocytes (en vert) à un niveau inférieur à celui des cellules T CD4 positives.

Figure 7 : Ce graphe biparamétrique TCR γδ en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le TCR γδ est une sous-unité du récepteur des cellules T et est exprimé sur une petite sous-population de cellules T cytotoxiques. Ces cellules présentent généralement une diffusion orthogonale faible (en bleu turquoise).

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Tube de cellules T

Figure 10 : Ce graphe biparamétrique CD56 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD56 est normalement exprimé sur une sous-population principale de cellules NK (en rouge), sur les cellules T à activité NK (cellules NK/T) et sur de nombreuses cellules T gamma/delta (en bleu turquoise). Le CD56 est également partiellement exprimé sur lesmonocytes (en vert) dans des conditions à la fois réactives et néoplasiques.

Figure 9 : Ce graphe biparamétrique CD2 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD2 est un antigène exprimé par presque toutes les cellules T matures et immatures (en bleu turquoise). Le CD2 est également exprimé sur les cellules NK (en rouge, en bas à droite) et à un faible niveau sur les monocytes (en vert).

Figure 12 : Ce graphe biparamétrique CD34 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD34 est un marqueur des progéniteurs hématopoïétiques précoces. Il est exprimé sur les cellules souches hématopoïétiques, les progéniteursmyéloïdes précoces (myéloblastes) et les cellules B et T immatures (lymphoblastes). Les granulocytes matures, les monocytes et les lymphocytes sont négatifs pour le CD34. Les progéniteurs CD34 positifs représentent normalementmoins de0,01 %des globules blancs contenus dans le sangpériphérique.

Figure 11 : Ce graphe biparamétrique CD5 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD5 est exprimé sur la plupart des cellules T matures et immatures (en bleu turquoise) et à un niveau faible sur une sous-population de cellules B matures. Les cellules T immatures très précoces et les cellules T gamma/delta présentent généralement une expression de CD5 faible, voire absente. Une petite sous-population de cellules NK exprime le CD5.

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Tube de cellules T

Figure 13 : Ce graphe biparamétrique CD7 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD7 est exprimé sur les cellules T immatures au stade le plus précoce du développement des cellules T, perdure tout au long de la maturation des cellules T et est exprimé de manière variable sur les cellules Tmatures (en bleu turquoise). Il est également exprimé uniformément sur les cellules NK (en rouge, en bas à droite) et faiblement exprimé sur une sous-population de cellules dendritiques plasmacytoïdes et une sous-population de progéniteurs CD34 positifs. engagés dans la lignée.

Figure 14 : Ce graphe biparamétrique CD8 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD8 est exprimé sur une sous- population de cellules T matures et immatures (en bleu turquoise) et définit la population de cellules T matures cytotoxiques. Il est exprimé de manière variable à un faible niveau sur les cellules NK et les cellules T gamma-delta.

Figure 15. Ce graphe biparamétrique CD3 en fonction de CD56 montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). Les cellules T sont définies par l’expression de CD3, car elle est présente sur toutes les cellules T matures et pas sur les cellules d’autres lignées. Les cellulesNK, par définition, n’expriment pas deCD3 en surface, mais expriment le CD56 sur une sous-population principale (en rouge, en haut à gauche). De petites sous-populations de cellules T matures expriment également le CD56, en particulier les cellules T à activité NK (cellules NK/T) et les cellules T gamma-delta.

Figure 16. Ce graphe biparamétrique CD5 en fonction de CD3 montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). Le CD3 et le CD5 sont coexprimés sur la plupart des cellules Tmatures (en bleu turquoise), bien qu’une petite sous-population de cellules T cytotoxiques avec une morphologie de grands lymphocytes granuleux présente souvent une expression de CD5 réduite, voire nulle. Le CD5 n’est pas exprimé sur la plupart des cellules NK.

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Tube de cellules T

Figure 17. Ce graphe biparamétrique CD7 en fonction de CD2 montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). Le CD2 et le CD7 sont coexprimés sur la grande majorité des cellules T matures (en bleu turquoise) et des cellules NK (en rouge, en haut à droite).

Figure 18. Ce graphe biparamétrique CD8 en fonction de CD4 montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). Les cellules T CD3 positives (en bleu turquoise) contiennent des sous-populations CD4 positives (auxiliaires) et CD8 positives (cytotoxiques). Les cellules T CD4 positives sont généralement plus nombreuses que les cellules T CD8 positives, avec un rapport CD4:CD8 allant de 1:1 à 4:1 dans le sang périphérique. Quelques cellules T doublement négatives ou doublement positives aux CD4 et CD8 sont également présentes. Généralement, les cellules T doublement négatives correspondent principalement aux cellules T gamma/ delta. Il convient de noter que les cellules CD4 positives, mais CD3 négatives (en rouge, au milieu à gauche) sont des monocytes inclus dans la fenêtre Lymphocyte. Cela démontre que le fenêtrage seul de CD45 en fonction de Side scatter (Diffusion orthogonale) ne permet pas l’identification des lymphocytes purs.

Figure 19. Ce graphe biparamétriqueCD3 en fonctiondeCD4montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). Toutes les cellules T CD4 positives expriment le CD3. Les monocytes et les cellules dendritiques plasmacytoïdes expriment le CD4 à un niveau inférieur à celui des cellules T CD4 positives et n’expriment pas le CD3. Les cellules NK n’expriment ni le CD3, ni le CD4.

Figure20.CegraphebiparamétriqueCD3enfonctiondeCD8montretoutes lescellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). Toutes les cellules T CD8 positives expriment le CD3 (en bleu turquoise). Une petite sous-population de cellules NK exprime également le CD8 (en rouge, en haut à gauche) sans le CD3.

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Tube de cellules T

Figure 21. Ce graphe biparamétrique CD3 en fonction de TCR γδ montre toutes les cellules dans la fenêtre Lymphocyte (Ly). Une petite sous-population de cellules T exprime le TCR gamma/delta, qui est coexprimé avec le CD3. La relation très linéaire entre CD3 et TCR est due à leur présence en tant que complexe hétérodimérique avec un rapport 1:1 fixe ; ainsi, une expression élevée de l’un révèle une expression élevée de l’autre.

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Tube de cellules M1

Figure 1 : Ce graphe biparamétrique TIME (Temps) en fonction de CD45 est non conditionné et montre tous les événements collectés de manière séquentielle. Ce graphe vise à évaluer la perturbation fluidique lors de l’acquisition des échantillons. Une acquisition stable est représentée par une disposition uniforme des événements au fil du temps. Les événements qui s’écartent du modèle stable peuvent être exclus dans la fenêtre Time (Temps).

Figure 2 : Ce graphe biparamétrique FS INT en fonction de FS PEAK montre les événements dans la fenêtre Time (Temps). Ce graphe vise à exclure les doublons de cellules ou les agrégats. Les événements de singulets présentent une relation linéaire pour INT en fonction de PEAK et sont inclus dans la fenêtre Singlets (Singulets), tandis que les doublons se trouvent en dehors de la relation linéaire.

Figure 4 : Ce graphe biparamétrique CD45 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre les événements dans la fenêtre Cells (Cellules). Ce graphe vise à mettre en évidence diverses sous-populations de globules blancs conditionnées par la fenêtre CD45 positive. La population CD45 négative comprend généralement des globules rouges, des agrégats de plaquettes, des débris de tissus ou des cellules non hématopoïétiques.

Figure 3 : Ce graphe biparamétrique Side Scatter (Diffusion orthogonale) en fonction de Forward Scatter (Diffusion axiale) montre les événements dans la fenêtre Singlets (Singulets). Ce graphe vise à exclure les débris cellulaires, qui ont généralement une diffusion axiale réduite et une diffusion orthogonale élevée. Les cellules apoptotiques précoces présentent également une diffusion orthogonale légèrement accrue, tandis que les cellules apoptotiques et nécrotiques tardives ont une diffusion orthogonale réduite,defaçonvariable.Lescellulesviablessont inclusesdans lafenêtreCells(Cellules).

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Tube de cellules M1

Figure 5 : Ce graphe biparamétrique CD45 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale)montre lesévénementsdans lafenêtreCD45+.Cegraphebiparamétrique permet de distinguer plusieurs populations de globules blancs que l’on trouve généralement dans les échantillons de sang périphérique, de moelle osseuse et de ganglions lymphatiques, notamment les lymphocytes (fenêtre Ly, en rouge), les monocytes (fenêtre Mo, en vert) et les granulocytes (fenêtre Gr, en bleu). La fenêtre CD45dim (en violet) couvre la zone habituellement occupée par les myéloblastes et les cellules B immatures. Des basophiles, des cellules dendritiques plasmacytoïdes, des plasmocytes et des cellules NK peuvent également apparaître dans cette zone. En appliquant différentes couleurs aux événements compris dans chaque fenêtre, il est possible de suivre les différentes populations tout au long de l’analyse.

Figure 6 : Ce graphe biparamétrique CD16 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD16 est exprimé à son niveau le plus élevé sur les granulocytes matures (en bleu). La plupart des cellules NK expriment le CD16 (en rouge, en bas à droite), tout comme une sous-population de monocytes activés (en vert).

Figure 8 : Ce graphe biparamétrique CD10 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD10 est exprimé sur les cellules B immatures, les cellules Bmatures du centre germinatif et les granulocytesmatures (en bleu). Les granulocytes présentent une diffusion orthogonale élevée, contrairement aux cellules lymphoïdes qui présentent une faible diffusion orthogonale.

Figure 7 : Ce graphe biparamétrique CD7 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD7 est exprimé sur les cellules T immatures au stade le plus précoce de leur développement, et perdure tout au long de leur maturation. Il est exprimé de manière variable sur les cellules T matures (en rouge, en bas à droite). Il est également exprimé sur les cellules NK et faiblement exprimé sur une sous-population de cellules dendritiques plasmacytoïdes et une sous-population de progéniteurs engagés dans la lignée.

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Tube de cellules M1

Figure 9 : Ce graphe biparamétrique CD13 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale)montretoutes lescellulesviables.LeCD13estexprimésur lesgranulocytes en maturation (en bleu), les monocytes matures (en vert), et les progéniteurs myéloïdes (en violet).

Figure 10 : Ce graphe biparamétrique CD64 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD64 est exprimé à son niveau le plusélevésur lesmonocytesmatures(envert).LeCD64n’estpasexprimécorrectement sur les granulocytes matures au repos (en bleu), mais son expression augmente avec l’activation des granulocytes. Le CD64 n’est pas exprimé sur les lymphocytes (en rouge), ni sur la plupart des progéniteurs CD34positifs. Lesmonocytesmatures activés expriment le CD64 à un niveau inférieur et ont une plus faible diffusion orthogonale.

Figure 11 : Ce graphe biparamétrique CD34 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD34 est un marqueur des progéniteurs hématopoïétiques précoces. Il est exprimé sur les cellules souches hématopoïétiques, les progéniteursmyéloïdes précoces (myéloblastes) et les cellules B et T immatures (lymphoblastes). Les granulocytes matures, les monocytes et les lymphocytes sont négatifs pour le CD34. Les progéniteurs CD34 positifs représentent normalementmoins de0,01 %des globules blancs contenus dans le sangpériphérique.

Figure 12 : Ce graphe biparamétrique CD14 en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le CD14 est exprimé à un niveau élevé sur les monocytes matures (en vert) et à un faible niveau sur les granulocytes matures (en bleu). Les monocytes matures activés expriment le CD14 à un plus faible niveau et ont une plus faible diffusion orthogonale.

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Tube de cellules M1

Figure 13 : Ce graphe biparamétrique HLA-DR en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale) montre toutes les cellules viables. Le HLA-DR est exprimé sur des cellules présentant des antigènes, notamment les monocytes (en vert) et les cellules dendritiques plasmacytoïdes. Il est également exprimé sur les progéniteurs CD34 positifs., les cellules B matures et immatures, ainsi que les cellules T activées.

Figure 14 : Ce graphe biparamétrique CD11b en fonction de Side Scatter (Diffusion orthogonale)montretoutes lescellulesviables.LeCD11bestexprimésur lesgranulocytes (en bleu) et sur les monocytes (en vert). Le CD11b est également exprimé sur les cellules NK et les basophiles.

Figure 16. Ce graphe biparamétrique CD16 en fonction de CD13 montre toutes les cellules viables. Le CD13 est exprimé sur les granulocytes (en bleu), les monocytes (en vert), les basophiles et les progéniteurs CD34 positifs. Le CD16 est exprimé sur les granulocytes en maturation (en bleu) et sur une sous-population de cellules NK (en rouge, en bas à droite).

Figure 15. Ce graphe biparamétrique CD11b en fonction de CD16 montre toutes les cellules viables. Le CD11b est exprimé sur les monocytes (en vert), les granulocytes matures et immatures (en bleu) et les cellules NK (en rouge). Le CD16 est exprimé sur les granulocytes matures et immatures (en bleu) et sur une sous-population de cellules NK (en rouge, en haut à droite). Les monocytes matures activés expriment le CD16 à un niveau variable et sont positifs pour le CD11b.

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