SVM_3_2011

Э кзотические животные • ния установлено большое разнообра- зие изолятов, а при определении ан- тибиотикочувствительности в неко- торых изолятах выявлена низкая чув- ствительность. Мы не смогли обнару- жить гены, кодирующие БЛРС, однако мы обнаружили ген pilL , который пре- жде наблюдался только в высоковиру- лентных штаммах P. aeruginosa . Та- ким образом, необходимо принимать в расчет риск инфицирования людей от домашних и лабораторных шиншилл. Поскольку болезнь у шиншилл быстро прогрессирует и часто приводит к ле- тальному исходу [10], с целью предот- вращения инфицирования синегной- ной палочкой необходима тщательная обработка места содержания шиншилл и мониторинг их здоровья. М етоды Выделение и идентификация P. aeruginosa у шиншилл сохранялись в глицерине при –80°C до проведения анализа. После этого 6 изолятов оказались невосстановимы и, следовательно, для анализа исполь- зовались 22 изолята. Для достоверно- сти идентификации сравнительный анализ проводился с двумя образцо- выми штаммами P. aeruginosa: ATCC 27853 (Американская коллекция ти- повых культур, Манассас, США) и IID 1130 (Институт медицины, Уни- верситет Токио, Япония). Содержа- ние шиншилл обеспечивалось сред- ствами из фонда по защите прав жи- вотных Японского университета ве- теринарии и медико-биологических наук (бывший Японский университет ветеринарии и зоотехнии) в соответ- ствии с Руководством по эксперимен- там над животными Японской ассоци- ации по лабораторным животным.

Определение антибиотико­ чувствительности МПК определялись как минимальная концентрация антибиотика, при кото- рой не наблюдается видимого роста после инкубации при 35°C в течение 24 часов. МПК антибиотиков во всех изолятах измерялась методом микро­ разведений в бульоне, описанным Ин- ститутом клинических и лабораторных стандартов [16]. Применялись следу- ющие антибиотики: гентамицин (ICN Biomedicals, США), амикацин (Bristol Laboratories, Бельвиль, Канада), имипе- нем (Merck, США), цефтазидим (LKT Laboratories, США), цефепим (Bristol- Myers Squibb, США), энрофлоксацин (MP Biomedicals, США) и ципрофлок- сацин (LKT Laboratories). Все антибио- тики перед определением чувствитель- ности были приведены к желаемым концентрациям в бульоне Мюллера- Хинтона II со стандартным содержани- ем катионов (BD, США). Каждый экс- перимент был повторен не менее 3 раз. Все изоляты исследовались на предмет продукции МБЛ с помощью металло- бета-лактамазы SMA «Eiken» (Eiken, Токио, Япония). Для верификации антибиотикочувствительности изоля- тов значения МПК аминогликозидов, ципрофлоксацина, имипенема и цеф- тазидима сравнивались со стандартами НККЛС [16]. Манипуляции с ДНК Мы использовали ПЦР для выявле- ния генов, кодирующих разные типы БЛРС, встречающиеся у синегнойной палочки, с помощью методик Jiang с соавт. [17] и Weldhagen [8]. Краткое описание метода: ПЦР использова- лась для выявления генов, кодирую- щих бета-лактамазы: OXA-10, TEM, SHV, PER-1, CTX группы 1, CTX груп- пы 2, CTX группы 9, VEB-1 и GES. Ам- пликоны были подтверждены с помо- щью электрофореза в агарозном геле, и визуализированные бэнды были впо- следствии очищеныSuprecPCR (Takara bio, Сига, Япония). Очищенные продук- тыПЦР были лигированы с Т-вектором, pTAC-1, спомощьюнаборадляклониро- вания TA PCR (Biodynamics laboratory, Токио, Япония), и получившиеся плаз- миды, трансформированные в DH5 a E. coli , помещали на среду Луриа- Бертани с добавлением ампициллина в

Пульс-электрофорез Пульс-электрофорез проводился по описанной ранее методике [32, 33]. Краткое описание: все изоляты, выра- щенные в течение ночи в питательном бульоне при 37°C, были отцентрифу- гированы при 10000 g в течение 2 ми- нут. Затем осадок был перерастворен и смешан с 1%-ной агарозой, после чего лизировался в течение 1 часа при 37°C и ферментировался протеиназой К в течение 16 часов при 50°C. После четырехкратного промывания все об- разцы были разрезаны с помощью ре- стриктазы Spe I в течение 16 часов при 25°C. Затем фрагменты были разделе- ны с помощью электрофореза в геле с 1%-ной агарозой на аппарате CHEF- DR (Bio-Rad, Калифорния, США) в те- чение 18 часов с временем переклю- чения от 5,3 с до 34,9 с и силой поля 6 В/см 2 . В качестве маркеров моле- кулярного веса использовались ре- стрикционные фрагменты ДНК фага лямбда (Bio-Rad). Затем гели протрав- ливались в течение 20 минут броми- дом этидия, а потом в течение 20 ми- нут обесцвечивались. После полу- чения фотоснимков в ультрафиоле- те паттерны фрагментов сравнива- лись визуально и с помощью невзве- шенного попарно-группового метода со средними арифметическими с по- мощью программы NTSYSpc (Exeter Software, США) по описанной ранее методике [34].

Выделение синегнойной палочки было произведено у 67 шиншилл, в том числе у 23 домашних и 44 лабо- раторных, выращенных в 2 питомни- ках для лабораторных животных. Все они были здоровы и не имели симпто- мов инфекции, 1 шиншилла со сред- ним отитом были исключена из ис- следования. В дальнейшем 2 лабора- торных шиншиллы получали лечение энрофлоксацином в течение 6 дней и гентамицином в течение 2 дней в свя- зи со средним отитом. Они полностью вылечились от отита перед забором образцов. У каждой шиншиллы из ро- товой полости, с морды и из индиви- дуальных поилок брались соскобы, которые затем растворяли в стериль- ном солевом растворе. Образцы посе- яли на агар с цетримидом и налидик- совой кислотой (Nissui, Токио, Япо- ния) и культивировали в течение 48 часов при 37°C. Изоляты идентифи- цировали по пигментированию коло- ний, окрашиванию по Граму и ката- лазной активности. После этого иден- тичность P. aeruginosa подтвержда- лась с помощью набора Quick ID GN «Nissui» (Nissui). Серотип изолятов P. aeruginosa устанавливался с помо- щью набора для слайд-агглютинации (Denka Seiken, Токио, Япония). Изо- ляты, которые не реагировали ни с одной антисывороткой, признавались нетипируемыми штаммами. Изоляты

44

С О В Р Е М Е Н Н А Я В Е Т Е Р И Н А Р Н А Я М Е Д И Ц И Н А

Made with